蛇毒類凝血酶AhV_TL-I和四種蛇毒磷脂酶A2的結(jié)構(gòu)功能研究.pdf

1、蛇毒中含有豐富的蛋白酶類，如蛇毒類凝血酶和蛇毒磷脂酶A2(PLA2)等。這些蛇毒蛋白酶類不僅有相應(yīng)底物的酶催化水解活性，還具有廣泛的生物學(xué)功能。蛇毒類凝血酶都是通過第195位的絲氨酸攻擊并切斷纖維蛋白原分子的Arg-Gly肽鍵，以此產(chǎn)生水解作用。蛇毒PLA2則能夠催化磷酸甘油三酯的sn-2位酯鍵的水解，生成脂肪酸和溶血磷脂。蛇毒類凝血酶和蛇毒PLA2都具有諸如溶血、凝血、抗菌、細(xì)胞毒性和神經(jīng)毒性等功能，除此之外，蛇毒蛋白還能夠結(jié)合到特定

2、細(xì)胞受體上，影響細(xì)胞的功能調(diào)控。
　　 細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的調(diào)節(jié)對于維持細(xì)胞靜息態(tài)下胞內(nèi)低Ca2+濃度、調(diào)節(jié)細(xì)胞興奮性、參與質(zhì)膜上的Na+/Ca2+交換以及細(xì)胞的發(fā)育、老化和健康都非常重要。肌漿網(wǎng)鈣庫是平滑肌細(xì)胞內(nèi)的主要Ca2+存貯庫，鈣庫Ca2+釋放對肌細(xì)胞興奮-收縮耦聯(lián)的觸發(fā)起決定作用。在平滑肌細(xì)胞的肌漿網(wǎng)膜上，存在兩類Ca2+釋放通道:Ryanodine受體(RyRs)和IP3受體(IP3Rs)。兩類通道協(xié)同調(diào)節(jié)肌漿網(wǎng)鈣庫

3、Ca2+釋放，引發(fā)平滑肌細(xì)胞興奮并收縮。
　　 江浙蝮蛇粗毒在經(jīng)過兩步層析純化并經(jīng)過精氨酸酯酶活性的測定，得到蛇毒類凝血酶AhV_TL-Ⅰ。利用N端測序及3＇-RACERT-PCR得到了該蛋白的氨基酸序列。AhV_TL-Ⅰ包含239個氨基酸，與多數(shù)蛇毒類凝血酶具有較高同源性。序列分析表明AhV_TL-Ⅰ為糖蛋白，其糖含量約11％。它具有精氨酸酯酶活性和纖維蛋白原水解活性，并可被PMSF和Cysteine完全抑制，但一些天然的絲氨

4、酸蛋白酶抑制劑(如SBTI、Leupeptin和Heparin)對其酶活只具有部分抑制效應(yīng)。納摩爾級濃度的AhV_TL-Ⅰ即能夠引起分離的小鼠胸主動脈環(huán)產(chǎn)生收縮效應(yīng)，并且這種活性與其酶活性無關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，AhV_TL-Ⅰ并不激活平滑肌細(xì)胞膜上的K+通道和Ca2+通道，卻能夠通過間接的調(diào)控激活細(xì)胞內(nèi)肌漿網(wǎng)膜上的RyRs的開放。在AhV_TL-Ⅰ的晶體結(jié)構(gòu)模型中，能觀察到Asn95A上糖基化修飾的存在。對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，Asn95-寡糖

5、對99-loop的構(gòu)象產(chǎn)生了非常大的影響。糖基化的修飾使得99-loop被“壓扁”，從而向兩側(cè)伸展。伸展的結(jié)果導(dǎo)致99-loop遠(yuǎn)離類凝血酶的底物結(jié)合位點(diǎn)S2并占據(jù)結(jié)合位點(diǎn)S3/S4。99-loop的擠壓同樣使得174-loop更凸向蛋白表面，兩者之間形成的底物結(jié)合裂縫消失。這從底物的親和性方面解釋了AhV_TL-Ⅰ只具有較低酶催化活性的原因。另一方面，Asn95A-寡糖位于底物結(jié)合口袋上方，形成一種“糖介導(dǎo)的空間障礙”，同樣降低了酶對

6、底物的水解活性。去糖實(shí)驗(yàn)表明Asn95A寡糖鏈的切除能夠部分提高AhV_TL-Ⅰ的酶催化活性，驗(yàn)證了我們對其結(jié)構(gòu)分析上的猜測。37-loop上氨基酸的突變使得其天然大分子抑制劑結(jié)合位點(diǎn)的電性發(fā)生巨大改變，大量正電荷氨基酸的聚集改變了AhV_TL-Ⅰ對抑制劑的選擇性。對糖切除的AhV_TL-Ⅰ的功能分析表明，糖基化對于AhV_TL-Ⅰ發(fā)揮血管收縮活性是必須的。這為蛇毒糖蛋白的研究提供了全新的視角。
　　 江浙蝮蛇粗毒和竹葉青粗毒經(jīng)

7、過多步層析法能夠分別得到AhV_bPA、AhV_aPA和PA2-Vb、CTs-R6四個蛋白，它們皆屬于蛇毒PLA2家族。序列分析表明，AhV_bPA和CTs-R6屬于堿性PLA2，AhV_aPA和PA2-Vb為酸性PLA2。49位殘基的不同可將這四種蛇毒PLA2分為兩類:CTs-R6屬于Asn49-PLA2，其余三者屬于Asp49-PLA2。因此CTs-R6不具有磷脂水解活性，而AhV_bPA具有中等酶活性，AhV_aPA和PA2-Vb

8、具有較高酶活性。對四者的結(jié)構(gòu)分析表明，CTs-R6中Ca2+結(jié)合位點(diǎn)的變化使得其無法結(jié)合Ca2+離子，從而喪失酶催化活性。而酸性PLA2和堿性PLA2中i-face上的氨基酸變化使得兩者的酶活性產(chǎn)生了較大的差異。AhV_TL-Ⅰ在溶液中主要以二聚體形式存在，二聚體界面由C-loop和Ca2+-loop組成。PA2-Vb也具有二聚化的傾向，其在晶體中的二聚化作用界而主要由疏水的i-face構(gòu)成。在AhV_bPA結(jié)構(gòu)中有天然甘油磷脂的存在，

9、它在AhV_bPA中的定位對于研究PLA2結(jié)合底物的方式提供了很好的幫助。除CTs-R6外，其余三種蛇毒PLA2都具有收縮小鼠胸動脈環(huán)的能力，并且與它們的酶活性無關(guān)。三種蛇毒PLA2分子同樣不激活質(zhì)膜上的離子通道的開放，而是通過間接的方式激活細(xì)胞內(nèi)肌漿網(wǎng)上的IP3Rs來產(chǎn)生鈣庫Ca2+釋放，從而引發(fā)平滑肌細(xì)胞的興奮-收縮耦聯(lián)。
　　 通過在組織和細(xì)胞層面對蛇毒蛋白激活Ca2+釋放的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析，我們提出了AhV_TL-Ⅰ和AhV

10、_bPA、AhV_aPA、PA2-Vb調(diào)節(jié)鈣庫Ca2+釋放的機(jī)制:蛇毒蛋白一方面可能通過結(jié)合到質(zhì)膜上的特定受體上，引起受體構(gòu)象變化，釋放信使分子，信使分子通過胞內(nèi)傳遞途徑激活肌漿網(wǎng)的RyRs或IP3Rs;另一方面，蛇毒蛋白可能結(jié)合到質(zhì)膜上的DHPR通道（或BKca、TRPC通道），通過通道與RyRs（或IP3Rs）的物理聯(lián)系調(diào)控RyRs（或IP3Rs）的激活。RyRs或IP3Rs釋放的鈣庫Ca2+進(jìn)一步正反饋激活各種離子通道，誘發(fā)胞外C