一種新的蛇毒磷脂酶A2同源物的純化及其抗腫瘤活性研究.pdf

1、蛇廣泛分布于世界各地，種類繁多。自古以來(lái)，蛇毒一直是傳統(tǒng)中醫(yī)使用最廣泛的中藥材之一。因此，對(duì)蛇毒中的生物活性成份的研究與開(kāi)發(fā)一直是基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和制藥工業(yè)關(guān)注的重要研究領(lǐng)域。中國(guó)蛇種豐富，在已發(fā)現(xiàn)的200多種蛇種及亞種中，至今只對(duì)少數(shù)幾種粗毒或部分純化的蛋白組份進(jìn)行了抗腫瘤作用研究，絕大部分蛇毒抗腫瘤成份還沒(méi)有被發(fā)掘出來(lái)。 磷脂酶A2(phospholipaseA2，PLA2)能夠在磷脂甘油部分的磷脂?；?sn-2)位點(diǎn)選擇性斷裂酯鍵

2、，生成的產(chǎn)物為溶血磷脂和脂肪酸[1],這種酶幾乎存在于所有蛇的毒液中。由于蛇的種類和生活環(huán)境的不同，PLA2在結(jié)構(gòu)和功能上也存在著很大的差異[2]。在蛇毒中存在許多PLA2同工酶，它們之間的氨基酸序列的同源性大于90％，結(jié)構(gòu)也較為相似，但卻具有不同的藥理生理功能[3]。 基于上述背景，本研究以我國(guó)南方地區(qū)富有的蝮蛇蛇毒為分離樣品源，擬建立一種簡(jiǎn)易、快速分離制備蛇毒蛋白的方法；并對(duì)從蝮蛇蛇毒中分離得到的蛇毒蛋白組份進(jìn)行抗腫瘤活性的

3、篩選與評(píng)價(jià)，旨在發(fā)現(xiàn)新的具有抗腫瘤作用的蛇毒多肽，為蛇毒在抗腫瘤治療中的應(yīng)用提供新的藥物。 本文的主要結(jié)果與結(jié)論如下： 一、建立了一種從蛇毒粗毒中一次性快速分離純化蛇毒蛋白組份的高效液相色譜層析方法。 根據(jù)目前所見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，從蛇毒粗毒分離蛋白組份一般都采用二步或三步以上的方法。為了能實(shí)現(xiàn)一次性快速?gòu)纳叨敬侄局蟹蛛x蛋白組份，我們對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行了改進(jìn)，采用了大顆粒(粒徑300(A))的C18反相硅膠作為高效液相

4、色譜柱的填充料，以乙腈/水(0.1％三氟乙酸)作為洗脫體系，在0～120min內(nèi)作梯度洗脫。采用該方法一次從蝮蛇粗毒中分離出了16個(gè)蛋白組份。 二、高效液相色譜分離得到的16個(gè)蛋白組份的純度鑒定 利用反相高效液相色譜法分別對(duì)從蛇毒粗毒中分離得到的16個(gè)蛋白組份進(jìn)行純度鑒定。C18反相色譜柱，乙腈/水(0.1％三氟乙酸)為流動(dòng)相，0～40min梯度洗脫。在上述色譜條件下，一次分離得到的16個(gè)蛇毒蛋白組份的蛋白質(zhì)純度均達(dá)到了

5、95％以上，說(shuō)明本文所建立的方法對(duì)蛇毒蛋白的分離具有快速、高純度的效果。 三、高效液相色譜分離的16個(gè)蛇毒蛋白組份的分子量確定 分別利用電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)和基質(zhì)輔助激光解吸附-飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)對(duì)分離得到的16個(gè)蛋白組份進(jìn)行了分子量測(cè)定，其中組份1、2、3、4、5、6、8、9、10、12、15和16共12個(gè)組份的分子量分別是1234.615、1234.575、7480、7554、1390

6、0、14504、13912、13962、13974、24748、23337和22695Da。 四、高效液相色譜法分離的蛋白組份的蛋白濃度測(cè)定 采用Bradford方法分別對(duì)16個(gè)蛋白組份進(jìn)行了蛋白濃度的分析，以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。16個(gè)蛋白組份從No.1～16的蛋白濃度以次為0.631、2.653、5.780、0.983、10.545、4.586、10.680、15.320、14.460、14.

7、840、54.250、106.958、104.360、69.590、64.858和137.608μg/mi。各組份蛋白濃度的差異很大，說(shuō)明在蝮蛇粗毒中的含量不同。 五、高效液相色譜分離的蛋白組份對(duì)人肝癌Hep3B細(xì)胞抗腫瘤活性的形態(tài)學(xué)影響 以培養(yǎng)人肝癌Hep3B細(xì)胞為模型，對(duì)分離得到的16個(gè)蛋白組份進(jìn)行了抗腫瘤活性的篩選與評(píng)價(jià)。在這16個(gè)蛋白組份中，組份3、4、5對(duì)培養(yǎng)人肝癌Hep3B細(xì)胞有明顯的抗腫瘤活性，我們將這三個(gè)

8、蛋白組份分別命名為AHP-3(蝮蛇英文AgkistrodonHalysPallas第一個(gè)字母的縮寫)、AHP-4、AHP-5。本文研究考查了AHP-5對(duì)人肝癌Hep3B細(xì)胞抗腫瘤活性的形態(tài)學(xué)影響。 在無(wú)AHP-5處理的情況下，Hep3B細(xì)胞呈單層生長(zhǎng)，細(xì)胞分布均勻，成梭形，生長(zhǎng)良好。用140μg/ml的AHP-5處理Hep3B細(xì)胞，24h后，倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)明顯較對(duì)照組差，并且細(xì)胞的體積變小、變形，細(xì)胞出現(xiàn)皺縮

9、、變圓、脫落等現(xiàn)象；透射電鏡觀察結(jié)果顯示：細(xì)胞體積縮小，染色質(zhì)濃縮，細(xì)胞核裂解為碎塊。說(shuō)明AHP-5對(duì)Hep3B細(xì)胞具有明顯的抑制和凋亡作用，AHP-5對(duì)培養(yǎng)人肝癌Hep3B細(xì)胞有明顯的抗腫瘤活性。 六、電泳法確定AHP-5的肽鏈結(jié)構(gòu) 我們采用SDS還原電泳法鑒定AHP-5的肽鏈結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，AHP-5在還原電泳條件下，呈出現(xiàn)一條區(qū)帶，表明AHP-5為單一肽鏈組成的蛋白質(zhì)。 七、AHP-5N-端部份氨基酸序列的

10、測(cè)定 采用Edman降解法對(duì)AHP-5N-端第1至第15位的氨基酸進(jìn)行了序列測(cè)定，結(jié)果表明，AHP-5N-端15個(gè)氨基酸序列依次為HLLQFRKMIKKMTKK。經(jīng)GenBank中protein-proteinBLAST的檢索，AHP-5的氨基酸序列與目前已知的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比較，未檢索到與AHP-5N-端第1位至第15位氨基酸一致的氨基酸序列，表明AHP-5是一種新的蛇毒多肽。同時(shí)AHP-5N-端的15個(gè)氨基酸與已知的其它蛇毒

11、磷脂酶A2(PLA2)具有較高的同源性，因此初步推測(cè)該組份為PLA2同源物。 八、AHP-5對(duì)人肝癌Hep3B細(xì)胞抗腫瘤活性機(jī)理的初步研究 由于我們從蛇毒中分離提純出的PLA2同源物為一新發(fā)現(xiàn)的蛋白組份，其生理藥理效應(yīng)未知，因此我們應(yīng)用SuperArray芯片，對(duì)其進(jìn)行初步的機(jī)理探索。 結(jié)果顯示，用140μg/mlPLA2同源物作用于Hep3B細(xì)胞12h后，在所選擇的112個(gè)基因中，有19個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，20個(gè)基

12、因表達(dá)上調(diào)。在下調(diào)基因中，下調(diào)倍數(shù)超過(guò)10倍的3個(gè)基因，ICAM-1，Integrinα1和LFA1b的主要功能都是介導(dǎo)細(xì)胞黏附。在上調(diào)基因中，上調(diào)倍數(shù)超過(guò)10倍的基因有Bcl-2和Fas，其主要功能是參與細(xì)胞調(diào)亡和衰老；Integrinαv，其主要功能是參與細(xì)胞黏附；Thrombospondin2，其主要功能是參與血管生成；MTS1和PAI-2，其主要功能是參與腫瘤細(xì)胞入侵和轉(zhuǎn)移。PLA2同源物具有極為廣泛的作用靶點(diǎn)。 九、A

13、HP-5對(duì)人肝癌Hep3B細(xì)胞周期變化和Ca2+濃度的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的變化，結(jié)果顯示：Hep3B細(xì)胞經(jīng)140μg/ml和208μg/ml的AHP-5處理后，G1期細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，而S期細(xì)胞逐漸增多，G2期則沒(méi)有明顯的變化。結(jié)果說(shuō)明：AHP-5可以抑制Hep3B細(xì)胞的生長(zhǎng)，使細(xì)胞停滯于S期。此外，經(jīng)過(guò)處理后的細(xì)胞，其二倍體峰前均發(fā)現(xiàn)有明顯的亞G1峰(凋亡峰)，提示有凋亡現(xiàn)象的發(fā)生。共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)AHP-

14、5處理后的細(xì)胞，其膜外表面有明顯的磷脂酰絲氨酸表達(dá)，Hep3B細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度明顯升高，說(shuō)明AHP-5誘導(dǎo)Hep3B細(xì)胞凋亡。 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本論文的結(jié)論如下： 一、建立了一種從蝮蛇蛇毒粗毒中快速分離蛋白組份的高效液相色譜方法。該方法采用大孔徑反相硅膠C18制備層析柱，以乙腈/水(0.1％三氟乙酸)為流動(dòng)相，在時(shí)間為0～120min進(jìn)行梯度洗脫，能一次性從蝮蛇粗毒中分離出16個(gè)純度達(dá)95％以上的蛇毒蛋白組份。

15、 二、在分離得到的16種蛇毒蛋白組份中，有三種組份在體外對(duì)人肝癌Hep3B細(xì)胞有抗腫瘤活性。形態(tài)學(xué)結(jié)果表明，140μg/ml的AHP-5處理Hep3B細(xì)胞24h后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)明顯較對(duì)照組差，并且細(xì)胞的體積變小、變形，細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落等現(xiàn)象；透射電鏡觀察結(jié)果顯示：細(xì)胞體積縮小，染色質(zhì)濃縮，細(xì)胞核裂解為碎塊。說(shuō)明AHP-5對(duì)Hep3B細(xì)胞具有明顯的抑制和促凋亡作用，抗腫瘤活性明顯。 三、凝膠電泳、分子量測(cè)

16、定和氨基酸序列分析的結(jié)果表明，AHP-5的分子量為13900Da，是由一條多肽鏈組成的蛋白質(zhì)，N-端第1位至第15位的氨基酸序列為HLLQFRKMIKKMTKK。經(jīng)GenBank中的protein-proteiBLAST檢索及人工檢索，在已知多肽的N-端第1位至第15位氨基酸序列中，未發(fā)現(xiàn)與AHP-5結(jié)構(gòu)相同的多肽，但與磷脂酶A2(PLA2)具有較高的同源性，因此推測(cè)該組份為PLA2同源物。 四、對(duì)AHP-5抗腫瘤作用機(jī)理的初步