江浙蝮蛇毒中一種新的金屬蛋白酶的研究.pdf

1、蛇毒金屬蛋白酶(SVMPs)是蛇毒中的主要功能性蛋白質(zhì)之一，能引起出血、水腫、血壓過低、血容量過低、壞疽等病變。它的結(jié)構(gòu)中含有高度保守的Zn結(jié)合序列HEXXHXXGXXHD，與去整合素金屬蛋白酶(ADAMs)一起組成鋅金屬蛋白酶M12家族中的一個分支——Reprolysin。在本文中，我們主要研究了江浙蝮蛇中一種新的金屬蛋白酶的分離純化、理化性質(zhì)以及潛在應(yīng)用。
　　 在第一章緒論中，我們主要從金屬蛋白酶的研究背景、分類、空間結(jié)構(gòu)

2、、生物活性等方面詳細(xì)介紹了金屬蛋白酶的研究進(jìn)展。在這一章最后，介紹了本文中使用的研究金屬蛋白酶方法，包括紫外-可見吸收光譜法、聚丙烯酰胺凝膠電泳、蛋白質(zhì)N端測序、毛細(xì)管等點聚焦和生物質(zhì)譜分析法。
　　 在第二章中，我們利用離子交換層析和凝膠過濾層析等層析技術(shù)首次從江浙蝮蛇蛇毒中分離得到一種金屬蛋白酶(AHPM)。聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果表明AHPM是由兩條分子量約為50kDa的肽鏈通過二硫鍵連接組成的110kDa的蛋白質(zhì)。Edma

3、n測序結(jié)果表明AHPM的兩條肽鏈N端都是封閉的。LC-MS/MS鑒定出AHPM的8端肽段序列與一些P-Ⅲ型SVMPs序列具有很高的相似性。根據(jù)這些結(jié)果我們得出AHPM是一種P-Ⅲc型SVMPs的結(jié)論。
　　 在第三章中，我們主要研究了AHPM的一些基本的生化性質(zhì)和酶學(xué)性質(zhì)。AHPM的等電點約為7.9，含糖量為2.5％，是一個沒有出血活性的金屬蛋白酶。該蛋白分子中有Zn2+和ca2+離子的存在，每條多肽鏈上含有1個Zn2+和2個C

4、a+。它是一種α-纖溶酶，能夠水解纖維蛋白的Aα、Bβ鏈，且水解Aα鏈的速度比Bβ鏈快。絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF和苯甲脒對水解活性沒有影響。而EDTA和TCEP能夠完全抑制其水解纖維蛋白活性。AHPM還能水解纖維蛋白形成的纖維凝塊，但是水解纖維凝塊的能力比粗毒要弱。我們還利用酪蛋白為底物分別研究了Sr2+、Mg2+、Mn2+、Co2+、Zn2+、ca2+、Cu2+、Ni2+和Fe3+等金屬離子和EDTA、苯甲脒對AHPM水解活性的影響

5、。結(jié)果表明金屬離子Zn+在AHPM的水解活性中發(fā)揮著重要作用。
　　 在第四章中，我們研究了AHPM對血小板聚集情況的影響，并對影響機(jī)制做了初步研究。實驗結(jié)果表明AHPM能夠抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集，IC50值為280±10nM。EDTA會使這種抑制減弱，所以我們推測聚集抑制可能是水解纖維蛋白以及水解纖維蛋白產(chǎn)物共同作用的結(jié)果。AHPM也能夠抑制膠原誘導(dǎo)的血小板聚集，IC50值為200±8nM。在這種抑制中AHPM對膠原蛋白本