蛇毒金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究.pdf

1、研究了皖南尖吻蝮蛇毒強(qiáng)出血金屬蛋白酶acutolysin A的生物學(xué)活性.除了具有引起動(dòng)物皮下出血的活性外,它還具有降解纖維蛋白原,層粘連蛋白,纖粘連蛋白和明膠的蛋白水解活性.將acutolysin A的cDNA克隆進(jìn)兩種原核表達(dá)載體pET-22b和pET-15b,并在大腸桿菌中以包含體的形式表達(dá)了兩個(gè)重組acutolysin A,分別為A-22b和A-15b.經(jīng)體外變性,復(fù)性處理后,A-22b具有明顯的出血活性,其最低出血?jiǎng)┝考s8—1

2、0ug,但沒有對(duì)纖維蛋白原,層粘連蛋白,纖粘連蛋白和明膠的蛋白水解活性.與A-22b相比,A-15b既沒有出血活性,也沒有對(duì)這些蛋白的水解活性.將另一個(gè)來自巴西的非出血金屬蛋白酶(命名為BR)的cDNA也克隆進(jìn)兩種表達(dá)載體pET-22b和pET-15b;在大腸桿菌中以包含體的形式表達(dá)了兩個(gè)重組BR,分別為BR-22b和BR-15b.經(jīng)同樣的變復(fù)性處理后,BR-22b和BR-15b均沒有出血活性,但卻具有降解纖維蛋白原和明膠的活性.BR-

3、22b和BR-15b沒有顯示出對(duì)層粘連蛋白和纖粘連蛋白的水解活性.在上述研究基礎(chǔ)之上,通過PCR方法構(gòu)建了兩個(gè)嵌合體基因(分別為C1和C2);C1是由BR基因的5'端序列(330bp堿基)和acutolysin A的3'端序列(285bp堿基)構(gòu)成的嵌合體基因;C2是由acutolysin A基因的5'端序列(324bp堿基)和BR的3'端序列(336bp堿基)構(gòu)成的嵌合體基因.隨后將它們每個(gè)均克隆進(jìn)兩個(gè)表達(dá)載體pET-22b和pET-

4、15b中,因此得到四個(gè)表達(dá)質(zhì)粒,即pC1-22b,pC1-15b,pC2-22b和pC2-15b.在大腸桿菌中以包含體的形式表達(dá)了相應(yīng)的四個(gè)重組蛋白,即C1-22b,C1-15b,C2-22b和C2-15b.經(jīng)同樣的變復(fù)性處理后,初步測(cè)定了這些重組蛋白的生物學(xué)活性.與BR-22b和BR-15b類似,C1-22b和C1-15b具有較強(qiáng)的纖維蛋白原水解活性和明膠水解活性,但都沒有出血活性.與A-22b相似,C2-22b具有出血活性但沒有對(duì)這

5、些蛋白的水解活性.與A-15b相似,C2-15b既沒有出血活性,也沒有對(duì)這些底物的水解活性.這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果暗示:蛇毒金屬蛋白酶的N端主亞結(jié)構(gòu)域在出血活性上起關(guān)鍵作用并極大的影響酶對(duì)底物的選擇性.同時(shí),將皖南尖吻蝮蛇毒弱出血金屬蛋白酶acutolysin C的cDNA克隆進(jìn)表達(dá)載體pET-15b,并在大腸桿菌中以包含體的形式表達(dá)了重組acutolysin C,即C-15b.經(jīng)變復(fù)性處理后,C-15b的生物學(xué)行為與A-15b相似,即沒有表現(xiàn)出

6、血活性和對(duì)這些底物的蛋白水解活性.這間接暗示,蛇毒金屬蛋白酶的N端主亞結(jié)構(gòu)域?qū)ζ渖飳W(xué)活性產(chǎn)生重大影響.另外,用pET-15b載體在大腸桿菌中以包含體的形式分別表達(dá)了出血金屬蛋白酶acutolysin A的N端主亞結(jié)構(gòu)域和C端的小亞結(jié)構(gòu)域,其相應(yīng)的重組蛋白分別為An-15b和Ac-15b.Ac-15b包含了酶的催化中心;而An-15b為主亞結(jié)構(gòu)域的主體部分,不含有半胱氨酸殘基和酶的催化區(qū).經(jīng)變復(fù)性處理后,它們均不具有出血活性和對(duì)這些蛋白