一種新的蛇毒解離素同系物的分離及其生物學活性的研究.pdf

1、蛇毒中含有豐富的生物活性物質(zhì)，至今在我國已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的蛇類約有219種及亞種，其中毒蛇有50種，至今只對其中少數(shù)幾種粗毒或部份純化的蛋白組份進行了抗腫瘤作用的研究，絕大部份蛇毒抗腫瘤成份都沒有被發(fā)現(xiàn)。因此，對蛇毒中生物活性成份的研究與開發(fā)一直是我國醫(yī)藥學領域研究的重要課題。 基于上述背景，本論文是以我國華南地區(qū)富有的蝮蛇蛇毒為分離樣品源，建立快速分離純化蛇毒蛋白的方法，對蝮蛇蛇毒中分離的蛇毒蛋白組份進行抗腫瘤活性的篩選與評價，旨在發(fā)

2、現(xiàn)新的具有生物活性的蛇毒蛋白。 本論文的主要實驗結(jié)果如下：一、用HPLC法從蝮蛇粗毒中一次性快速分離蛋白組份AHP-4采用大孔徑C18反相硅膠柱在高效液相色譜上，0-120min內(nèi)用流動相三氟乙酸+乙腈進行洗脫，從蝮蛇粗毒中分離得到蛇毒蛋白組分AHP-4。 二、用HPLC法對從蝮蛇粗毒中分離的AHP-4進行了純度測定。AHP-4在HPLC圖譜上為單一對稱峰，主峰的相對百分含量為97.1％，表明采用上述分離方法能從蝮蛇粗毒

3、中分離得到高純度的AHP-4。 三、AHP-4的分子量測定采用高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀對AHP-4進行了分子量的測定。AHP-4分子量為7554Da。 四、AHP-4的蛋白濃度測定根據(jù)標準曲線和AHP-4的吸光度值，計算出AHP-4蛋白濃度為0.983μg/ml。五、AHP-4單一肽鏈結(jié)構(gòu)的測定采用非還原和還原SDS電泳法測定AHP-4的肽鏈結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，AHP-4在非還原和還原電泳條件下均為單一區(qū)帶，說明AHP-4由單一

4、肽鏈組成。 六、AHP-4N-端部分氨基酸測定采用Edman降解測序法測定AHP-4N-端第1位至第15位的氨基酸序列，結(jié)果顯示，AHP-4N-端第1位至第15位的氨基酸序列為GEECDCGSPANPCCD。經(jīng)GeneBankprotein-proteinBLAST檢索及人工檢索，在已知蛋白質(zhì)N-端第1位至第15位氨基酸序列中，未發(fā)現(xiàn)與AHP-4氨基酸結(jié)構(gòu)完全相同的蛋白質(zhì)。而AHP-4N端第1位至第15位氨基酸序列與5種解離素中

5、的氨基酸序列具有高度同源性，表明AHP-4是一種新的解離素同系物 七、AHP-4對體外ADP誘導的兔血小板聚集的作用用ADP作為誘導劑，觀察AHP-4在體外對兔血小板聚集的結(jié)果表明，AHP-4劑量依賴性的抑制ADP誘導的兔血小板聚集，IC50為4.607nM。 八、AHP-4對人肝癌Hep3B細胞抗腫瘤活性的形態(tài)學變化通過細胞形態(tài)學變化來觀察AHP-4在體外對人肝癌Hep3B細胞的抗腫瘤活性結(jié)果表明，AHP-4在3.88

6、μg/ml、16.9μg/ml和33.8μg/ml劑量時，能誘導細胞出現(xiàn)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的病理變化，表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤活性，并有劑量依賴性。 九、AHP-4對Hep3B細胞抗腫瘤作用機制的探討基因芯片的結(jié)果表明，AHP-4能上調(diào)或下調(diào)許多與腫瘤生長轉(zhuǎn)移密切相關基因的表達。其中AHP-4抑制五種整合素(integrinα2、α3、α4、β3和β5)基因的表達和促進兩種整合素(integrinα6和αv)基因的表達，抑制表皮生長因子EGF和

7、受體EGFR基因的表達，以及抑制基質(zhì)金屬蛋白酶9、組織抑制型基質(zhì)金屬蛋白酶1表達，可能與其抗腫瘤作用的機制有關。 根據(jù)上述實驗結(jié)果，本論文的結(jié)論如下：一、本實驗采用高效液相方法，從蝮蛇蛇毒中分離出一種新的解離素同系物。結(jié)構(gòu)確認的結(jié)果表明，AHP-4的分子量為7554Da，是由一條多肽鏈組成的蛋白質(zhì)，N-端第1位至第15位的氨基酸序列為GEECDCGSPANPCCD。經(jīng)GeneBankprotein-proteinBLAST檢索及

8、人工檢索，在已知蛋白質(zhì)N-端第1位至第15位氨基酸序列中，未發(fā)現(xiàn)與AHP-4氨基酸結(jié)構(gòu)完全相同的蛋白質(zhì)。AHP-4N端第1位至第15位氨基酸序列與5種解離素中的氨基酸序列具有高度同源性，表明AHP-4是一種新的解離素同系物。 二、AHP-4在體外能劑量依賴性地抑制誘導劑二磷酸腺苷(ADP)誘導的兔血小板聚集，IC50為4.607nM，說明AHP-4和大多數(shù)解離素一樣，具有抑制血小板聚集的作用。 三、AHP-4在體外對人肝

9、癌Hep3B細胞有較強的抗腫瘤活性。形態(tài)學結(jié)果表明，細胞在AHP-4處理后，使單層貼壁生長的Hep3B細胞出現(xiàn)網(wǎng)狀樣結(jié)構(gòu)的形態(tài)學病理變化，隨著時間延長，病變加重，直至細胞全部漂浮。AHP-4的上述抗腫瘤活性有明顯的劑量依賴性。 四、用基因芯片方法探討AHP-4抗腫瘤作用機理的初步結(jié)果表明，AHP-4能抑制五種整合素(integrinα2、α3、α4、β3和β5)基因的表達，促進兩種整合素(integrinα6和αv)基因的表達；