一種骨橋蛋白小分子肽的重組表達(dá)與生物學(xué)活性研究.pdf

1、目的：血管損傷部位新生內(nèi)膜的形成是動(dòng)脈粥樣硬化(AS)和血管成形術(shù)后再狹窄(PTCA)病理過(guò)程中的重要事件之一，當(dāng)血管內(nèi)膜受損時(shí)，位于血管中膜的血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)在生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的刺激下由收縮表型轉(zhuǎn)化為合成表型，并獲得向內(nèi)膜下遷移、增殖及合成和分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的能力。VSMC遷移主要是由ECM蛋白和細(xì)胞表面整合素受體(主要是αvβ3)相互作用所介導(dǎo)的。已經(jīng)證明，在各種ECM蛋白中，骨橋蛋白(OPN)與細(xì)胞遷移和黏

2、附的關(guān)系最為密切。OPN通過(guò)它所含有的RGD序列與整合素αvβ 3、αvβ 5相互作用，通過(guò)SVVYGLR序列與整合素α 9 β 1、α4 β1結(jié)合。已經(jīng)證實(shí)，含RGD和SVVYGLR序列的短肽能夠競(jìng)爭(zhēng)性的抑制OPN與多種整合素的結(jié)合，從而抑制VSMC以及炎性細(xì)胞的黏附和遷移。以小分子肽作為阻斷劑研究蛋白質(zhì)的功能是揭示細(xì)胞活動(dòng)調(diào)節(jié)機(jī)制的重要手段。本實(shí)驗(yàn)利用基因重組技術(shù)，將含有編碼RGD序列的cDNA片段與攜帶2×His-Trx-S·ta

3、g編碼序列的原核表達(dá)載體pET-32c(+)重組，構(gòu)建：pET-32c-RGD重組子，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，表達(dá)產(chǎn)物為His-Trx-S·tag-RGD融合蛋白(簡(jiǎn)稱His-RGD)。經(jīng)分離純化后獲得His-RGD純品，該短肽可作為阻斷劑用于研究OPN在體內(nèi)的生物學(xué)作用。 方法： 1.重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定將編碼RGD13肽的DNA(以下簡(jiǎn)稱RGD)片段經(jīng)Nco I/BamH I酶切位點(diǎn)克隆入pET-32

4、c(+)載體，構(gòu)建His-RGD融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒。通過(guò)雙酶切和序列分析對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。 2.His-RGD融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá) 2.1 His-RGD融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)將pET-32c-RGD轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，在不同條件下，用IPTG誘導(dǎo)后可檢測(cè)His-RGD融合蛋白的表達(dá)活性，并對(duì)IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)溫度進(jìn)行篩選優(yōu)化，確定His-RGD融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的最佳條件。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAG

5、E檢查融合蛋白在細(xì)胞中的存在形式。 2.2 His-RGD融合蛋白的分離純化取含有表達(dá)產(chǎn)物的細(xì)菌裂解液上清直接經(jīng)Ni-NTAHis Bind Resin金屬離子螯合層析進(jìn)行純化。 3.His-RGD融合蛋白生物學(xué)活性檢測(cè) 3.1黏附抑制實(shí)驗(yàn)取3-4代體外培養(yǎng)的VSMC分別與0、150、300、450mg/L的His-RGD融合蛋白預(yù)孵育1 h，然后將細(xì)胞接種到用BSA(20 mg/L)或OPN(20 mg/L)包

6、被的96孔板中，檢測(cè)單位時(shí)間(2h)內(nèi)黏附至孔板上的細(xì)胞數(shù)，以此表示細(xì)胞黏附活性。以融合蛋白洗脫液和2×His-Trx-S·tag蛋白作為平行對(duì)照，以確定His-RGD抑制細(xì)胞黏附的特異性。 3.2傷口愈合實(shí)驗(yàn)將VSMC接種于帶有玻片的孔板內(nèi)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至100％匯合后，分別加入0、150、300、450 mg/L的His-RGD預(yù)孵育1 h。取出玻片，用無(wú)菌吸頭在玻片上劃痕。隨即將玻片放回孔板內(nèi)，每孔加入20 mg/L OPN

7、或20 mg/L BSA 100μl，繼續(xù)孵育24 h后，于低倍鏡下觀察細(xì)胞傷口愈合程度，以此表示細(xì)胞的遷移活性。以融合蛋白洗脫液和2×His-Trx-S·tag蛋白作為平行對(duì)照，以確定His-RGD抑制細(xì)胞遷移的特異性。 結(jié)果： 1.重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32c-RGD的構(gòu)建與鑒定重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)NcoI和BamHI雙酶切，產(chǎn)物經(jīng)核酸電泳鑒定時(shí)出現(xiàn)長(zhǎng)度為50 bp的插入片段，與預(yù)期結(jié)果相一致。測(cè)序結(jié)果顯示插入片段的核酸序列

8、正確無(wú)誤。重組質(zhì)粒命名為pET-32c-RGD。 2.His-RGD融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)轉(zhuǎn)化pET-32c-RGD的宿主菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后可表達(dá)約18.71 kD的蛋白質(zhì)，與His-RGD融合蛋白分子量相一致，該融合蛋白主要以可溶性蛋白形式存在于胞漿。取培養(yǎng)物(OD600=0.6)按1:50接種于含0.01 mmol/L IPTG的LB培養(yǎng)液中，25℃誘導(dǎo)培養(yǎng)7 h時(shí)，His-RGD融合蛋白的表達(dá)量最大，此條件作為His-RGD融

9、合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的最佳條件。 3.His-RGD融合蛋白的純化經(jīng)Ni-NTA His Bind Resin金屬離子螯合層析進(jìn)行純化后，每100 ml培養(yǎng)物可得到約25 mg電泳純的可溶性His-RGD融合蛋白，純度為95％。 4 His-RGD融合蛋白對(duì)細(xì)胞黏附的影響?zhàn)じ揭种茖?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在所觀察的濃度范圍內(nèi)，His-RGD融合蛋白能劑量依賴性的抑制VSMC在OPN包被板上的黏附，在融合蛋白為450 mg/L時(shí)，抑制效果最

10、明顯。 5 His-RGD融合蛋白對(duì)細(xì)胞遷移的影響傷口愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，His-RGD能劑量依賴性的抑制VSMC遷移，在融合蛋白為450 mg/L時(shí)，抑制效果最明顯。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建了含有OPN RGD序列13肽基因單拷貝的pET-32c-RGD原核表達(dá)質(zhì)粒。 2.經(jīng)過(guò)對(duì)IPTG.濃度、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化，His-RGD融合蛋白在大腸桿菌中得到有效表達(dá)。 3.每100 ml培養(yǎng)