一種抗腫瘤蛋白基因在衣藻葉綠體中的重組與表達.pdf

1、本研究于1998年從藍藻中克隆獲得了別藻藍蛋白基因(apc)。將該基因重組到大腸桿菌表達質(zhì)粒PET28a+中，實現(xiàn)了該基因在大腸桿菌中的高效表達。但在大腸桿菌中表達的重組蛋白存在后期的分離純化繁瑣，需要包涵體復(fù)性以及含有大腸桿菌毒素等不利因素。由于rAPC口服給藥有效，這提示可以開發(fā)一種直接口服的治療癌癥的新藥。我們選擇了用衣藻葉綠體表達系統(tǒng)來表達這種藥用蛋白。為進一步開發(fā)口服抗腫瘤藥用蛋白奠定基礎(chǔ)。本論文研究的第一部分探索了進行衣藻葉

2、綠體轉(zhuǎn)化所涉及的各種方法，如：基因槍轉(zhuǎn)化參數(shù)、篩選方法及對轉(zhuǎn)化子的各種分子檢測方法等。通過對以上方法的探索，初步建立了利用同源重組方法在衣藻葉綠體中穩(wěn)定表達外源基因的體系?！　”菊撐难芯康牡诙糠謽?gòu)建了外源基因apc的衣藻葉綠體表達載體：papc-S，并用基因槍法將該載體導(dǎo)入衣藻細胞，通過抗性篩選后，在壯觀霉素抗性平板上得到了15個墨綠色的衣藻轉(zhuǎn)化子。經(jīng)過三輪抗性篩選后，利用一對分別互補于衣藻葉綠體chlL基因5’端和外源基因apc3

3、’端的引物對轉(zhuǎn)化子進行了PCR檢測，同時以apc基因為探針對轉(zhuǎn)化子進行了酶切Southern檢測，結(jié)果證實外源基因已經(jīng)定點整合到了衣藻葉綠體特定位點?！　∮捎谠诖竽c桿菌中重組的別藻藍蛋白β亞基的抗腫瘤活性大大高于完整的重組的APC蛋白。因此論文研究的第三部分構(gòu)建了別藻藍蛋白β亞基的衣藻葉綠體表達載體papc-B。用基因槍法將之導(dǎo)入衣藻細胞后，經(jīng)各種分子水平的檢測證實別藻藍蛋白β亞基在衣藻中獲得了表達，表達蛋白水平占衣藻可溶性總蛋白的3