密碼子優(yōu)化對豆血紅蛋白基因在萊茵衣藻葉綠體中表達(dá)和產(chǎn)氫的影響.pdf

1、萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)結(jié)構(gòu)簡單,遺傳學(xué)背景清晰,易于進(jìn)行分子操作,培養(yǎng)容易且成本較低,尤其是氫化酶的活性高,能夠利用太陽能和水產(chǎn)生氫氣,被認(rèn)為是目前最有開發(fā)潛力的生物制氫的模式物種。
　　 萊茵衣藻的氫化酶活性高但是對氧氣特別敏感,而氧氣又是光合作用的產(chǎn)物,所以在產(chǎn)氫的過程中,氫化酶很容易受氧氣抑制而失活,這是衣藻產(chǎn)氫的最大障礙。要想提高產(chǎn)氫效率達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的目的,就要降低衣藻細(xì)胞內(nèi)的氧

2、氣含量,保證氫化酶的活性。目前最常用的辦法是去除培養(yǎng)基中的硫元素或加入某些抑制劑來抑制光系統(tǒng)Ⅱ的活性,以減少光合作用產(chǎn)生的氧氣量,但是同時這樣也會降低光解水產(chǎn)生的電子量,使光合產(chǎn)氫的電子來源減少,導(dǎo)致產(chǎn)氫量降低。如何降低細(xì)胞內(nèi)的氧氣含量又不影響電子的供應(yīng)是提高萊茵衣藻產(chǎn)氫的關(guān)鍵問題。
　　 豆血紅蛋白(leghemoglaobin,Lb)與氧氣具有很高的親和力和快速的氧周轉(zhuǎn)率,能幫助降低根瘤細(xì)胞內(nèi)的氧氣濃度和保證氧敏感的固氮酶的

3、活性,沒有豆血紅蛋白的根瘤沒有固氮作用。
　　 本實(shí)驗(yàn)室前期工作已經(jīng)嘗試分別將大豆血紅蛋白的球蛋白基因lba和血紅素-球蛋白基因hemH-lba分別轉(zhuǎn)化到萊茵衣藻的葉綠體中表達(dá),以幫助降低細(xì)胞內(nèi)氧氣含量和提高產(chǎn)氫量。由于衣藻葉綠體中蛋白表達(dá)具有密碼子AT偏向性,本實(shí)驗(yàn)嘗試將hemH-lba基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化并轉(zhuǎn)入萊茵衣藻的葉綠體中表達(dá),以提高外源蛋白表達(dá)量和更好地發(fā)揮豆血紅蛋白的作用,提高衣藻產(chǎn)氫量。
　　 本論文的主要

4、內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　 1.將密碼子優(yōu)化后的豆血紅蛋白基因送公司合成,并成功構(gòu)建表達(dá)載體cg401-1-hemHc-lbac。該表達(dá)載體中的hemH基因和lbac基因設(shè)計為多順反子表達(dá)形式。
　　 2.利用基因槍法將載體cg401-1-hemHc-lbac轉(zhuǎn)化到農(nóng)藻藻株cc849(以下簡稱對照藻849)的葉綠體中,用抗生素——壯觀霉素篩選出轉(zhuǎn)基因藻。
　　 3.通過PCR和RT-PCR對轉(zhuǎn)基因衣藻hemHc-lb

5、ac進(jìn)行DNA和RNA水平的檢測,PCR結(jié)果表明hemHc和lbac基因片段已異質(zhì)化整合到轉(zhuǎn)基因衣藻葉綠體基因組中,RT-PCR結(jié)果表明hemHc和lbac基因在在葉綠體中成功轉(zhuǎn)錄。
　　 4.通過Western blotting的方法對轉(zhuǎn)基因衣藻hemHc-lbac進(jìn)行蛋白水平的檢測,結(jié)果表明正常培養(yǎng)條件和產(chǎn)氫培養(yǎng)條件下hemHc基因和lbac基因的蛋白在衣藻葉綠體中都得到了表達(dá),且都在第五天達(dá)到了最大值,表達(dá)量都是未優(yōu)化密碼

6、子轉(zhuǎn)基因藻hemH—lba的6.8倍。在非變性膠上的Western blotting雜交結(jié)果表明兩個多順反子表達(dá)的亞基電泳分離后在同一位置。
　　 5.用定量Real-time PCR的方法對氫化酶的表達(dá)量進(jìn)行檢測表明,產(chǎn)氫條件下轉(zhuǎn)基因藻hemH-lba和hemHc-lbac的氫化酶轉(zhuǎn)錄水平比對照藻849都有所提高。
　　 6.對對照藻849和轉(zhuǎn)基因藻hemH-lba、hemHc-lbac的生長情況進(jìn)行檢測表明:對照藻8

7、49飽和時的最大OD750值是3.2左右,轉(zhuǎn)基因衣藻hemH-lba飽和時的最大OD750值是3.5,轉(zhuǎn)基因衣藻hemHc-lbac飽和時的最大OD750值是3.3。達(dá)到飽和期時轉(zhuǎn)基因衣藻hemHc-lbac、hemH-lba的最大葉綠素含量均為41mg／L左右,而對照藻849的最大葉綠素含量為35mg／L左右。說明轉(zhuǎn)基因藻的生長并未受到抑制,其葉綠素含量反而有所增加。
　　 7.用氣相色譜對轉(zhuǎn)基因藻和對照藻產(chǎn)氫量和耗氧量進(jìn)行檢

8、測表明無論在黑暗耗氧法除氧還是沖氬法除氧的條件下轉(zhuǎn)基因衣藻hemHc-lbac比hemH-lba和對照藻的產(chǎn)氫量都高。
　　 8.用乙醚萃取血紅素,利用紫外分光光度計掃描樣品,在550nm處轉(zhuǎn)基因衣藻hemH-lba和hemHc-lbac有小的血紅素吸收峰,表明有微量血紅素合成。
　　 9.通過對對照藻849和轉(zhuǎn)基因藻hemH-lba、hemHc-lbac的呼吸速率和光合放氧速率的檢測表明,兩種轉(zhuǎn)基因藻的凈光合放氧速率都