血紅蛋白β亞基對RHDV復(fù)制的影響.pdf

1、兔出血癥病毒(Rabbit Hemorrhagic Disease Virus，RHDV)是杯狀病毒科兔病毒屬的一個成員，能夠引起成年家兔的兔病毒性出血癥，俗稱“兔瘟”。兔出血癥是由兔出血癥病毒引起的一種急性、敗血性高度致死性傳染病，死亡率高達(dá)100％，對養(yǎng)兔業(yè)具有毀滅性打擊。因為缺少合適的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，目前對RHDV的分子生物學(xué)研究很落后，特別是對兔病毒性出血癥病毒的分子致病機(jī)理的認(rèn)識仍然較少，所以有必要加強(qiáng)對該病毒的分子生物學(xué)基礎(chǔ)研

2、究。
　　RHDV基因組長約7.5kb，含有兩個開放閱讀框(open reading frame，ORF)，ORF1和ORF2，ORF1編碼一個大小約為257 kDa多聚蛋白，該多聚蛋白又被裂解為7個非結(jié)構(gòu)蛋白和1個結(jié)構(gòu)蛋白(VP60)，ORF2編碼次級結(jié)構(gòu)蛋白(VP10)。本實(shí)驗室前期工作發(fā)現(xiàn):兔病毒性出血癥病毒的VPg蛋白能夠與宿主的翻譯起始因子帽子結(jié)合蛋白eIF4E(eukaryotic initiation factor4

3、E)互作，這種相互作用是RHDV翻譯起始所需要的;VP60是兔瘟病毒的衣殼蛋白，含有579個氨基酸，相對分子質(zhì)量為60 kDa。VP60在病毒的感染、復(fù)制和免疫過程中占有重要地位。由于該病毒一直缺乏有效的體外增殖細(xì)胞系，有關(guān)RHDV的分子致病機(jī)理研究進(jìn)展十分緩慢，對于其與宿主之間的相互作用研究的更少。鑒于此，本論文擬篩選與病毒衣殼蛋白相互作用的宿主因子，并研究它們之間的互作對病毒復(fù)制的影響，以期為研究RHDV的感染及致病機(jī)理提供重要線索

4、。本論文開展的研究內(nèi)容主要包括以下三個方面。
　　(1)利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了含血紅蛋白β亞基的sgRNA的PX459-sgRNA重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染RK-13細(xì)胞，通過嘌呤霉素篩選陽性克隆，并提取細(xì)胞基因組DNA，設(shè)計引物對sgRNA靶點(diǎn)鄰近位點(diǎn)約500bp的基因組DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并通過測序鑒定以及WB驗證，結(jié)果表明成功建立了穩(wěn)定敲除HB的RK-13細(xì)胞系，并命名為RK-△HB細(xì)胞。本工作能夠為研究HB在病毒

5、生命進(jìn)程中的作用提供研究平臺。
　　(2)為了檢測生物樣品中的RHDV的含量，我們建立了基于SYBR Green能夠?qū)崟r檢測RHDV復(fù)制水平的熒光定量PCR方法。根據(jù)GenBank公布的RHDV和RHDV2 VP60基因保守區(qū)序列設(shè)計一對特異性引物進(jìn)行qPCR擴(kuò)增;RHDV和RHDV2熔解溫度分別為（86.3±0.1）℃和（85.1±0.1）℃，并且只觀察到一個特異性峰。這些結(jié)果顯示該方法不僅能夠靈敏、準(zhǔn)確特異地檢測RHDV的復(fù)制

6、，而且結(jié)合熔解曲線分析該方法也能夠快速地鑒別RHDV和RHDV2。
　　(3)我們利用CO-IP技術(shù)篩選出了與VP60相互作用的宿主蛋白，其中包含HB蛋白。我們對HB蛋白進(jìn)行進(jìn)一步研究。利用免疫共沉淀、GST pull down、亞細(xì)胞定位實(shí)驗證實(shí)了VP60和HB兩者存在相互作用，并且存在共定位現(xiàn)象。我們也發(fā)現(xiàn)在RK-13細(xì)胞中過表達(dá)HB基因能夠抑制RHDV復(fù)制過程，而敲除HB基因的細(xì)胞系中RHDV復(fù)制水平得到促進(jìn)。
　　綜