密碼子優(yōu)化的人生長(zhǎng)素基因在大腸桿菌及人生長(zhǎng)素基因在畢赤酵母中表達(dá)的研究.pdf

1、人生長(zhǎng)激素(hGH)是由人的腦垂體前葉合成分泌的一種非糖化蛋白類(lèi)激素，在人體生長(zhǎng)發(fā)育方面起著極其重要的作用。人生長(zhǎng)激素的主要生理功能是促進(jìn)人體生長(zhǎng)發(fā)育和維持組織器官的正常功能，如果缺乏就會(huì)產(chǎn)生侏儒癥及組織器官的萎縮和功能衰竭。除此之外，人生長(zhǎng)激素還可用于燒傷、骨折、創(chuàng)傷、出血性潰瘍、組織壞死、肌肉萎縮、骨質(zhì)疏松以及過(guò)渡肥胖等疾病的輔助治療。為了提高h(yuǎn)GH在大腸桿菌中的表達(dá)量，在不改變氨基酸序列的前提下，對(duì)編碼hGH的序列進(jìn)行了密碼子優(yōu)化

2、，構(gòu)建了原核重組表達(dá)載體，以期能夠降低成本。同時(shí)，由于畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)在重組蛋白表達(dá)方面的許多優(yōu)點(diǎn)，研究了目的基因在畢赤酵母中的表達(dá)情況，建立了畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的平臺(tái)，為工業(yè)化的生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。 本論文的主要內(nèi)容有三個(gè)部分： 1.密碼子優(yōu)化的人生長(zhǎng)素基因的全基因合成及克隆。 2.密碼子優(yōu)化的人生長(zhǎng)素基因在大腸桿菌中的表達(dá)。 3.人生長(zhǎng)素基因在畢赤酵母中的分泌表達(dá)。 結(jié)果及結(jié)論如下：

3、 1.根據(jù)人生長(zhǎng)素基因的氨基酸序列，選擇大腸桿菌所偏好的密碼子，人工設(shè)計(jì)并合成了20個(gè)寡核苷酸片斷。通過(guò)重疊區(qū)擴(kuò)增法，利用PCR成功地合成了人生長(zhǎng)激素基因的全序列。經(jīng)克隆測(cè)序，證明我們已成功地實(shí)現(xiàn)了人生長(zhǎng)素基因的合成及克隆。 2.T克隆測(cè)序正確后，利用NdeⅠ及BamHⅠ分別雙酶切表達(dá)載體pET-22b和目的片斷，構(gòu)建pET-hGH*表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)表達(dá)菌，IPTG誘導(dǎo)，提取周質(zhì)蛋白，SDS-PAGE、放射

4、免疫鑒定蛋白的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)目的蛋白表達(dá)量不僅沒(méi)有得到提高，反而表達(dá)量非常低甚至是不表達(dá)，優(yōu)化各種表達(dá)條件，蛋白表達(dá)量均沒(méi)有得到提高。于是換用pINIII-ompA3表達(dá)載體，同時(shí)對(duì)5'密碼子進(jìn)行了替換，重新構(gòu)建了pINIII-ompA-hGH*表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化BL(21)表達(dá)菌，37℃發(fā)酵15h，經(jīng)SDS-PAGE及放射免疫測(cè)定，蛋白表達(dá)量得到了很大提高，BandScan凝膠掃描軟件分析目的蛋白約占總蛋白的25％左右，放射免疫測(cè)定蛋白表

5、達(dá)量約為18mg/L左右。因此可以初步得出結(jié)論：密碼子設(shè)計(jì)需要進(jìn)一步優(yōu)化。同時(shí)，密碼子優(yōu)化只是影響蛋白表達(dá)量的一個(gè)因素，質(zhì)?？截悢?shù)、基因二級(jí)結(jié)構(gòu)、蛋白穩(wěn)定性、翻譯效率、培養(yǎng)條件以及蛋白表達(dá)載體的選擇等都與蛋白表達(dá)水平有關(guān)。 3.用PCR技術(shù)從質(zhì)粒pCDNA3.0/hGH擴(kuò)增得到hGH基因。將其插入含有AOX1啟動(dòng)子和α分泌信號(hào)肽序列的畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K/hGH，轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，篩選