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文檔簡介
1、葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，簡稱GOD)廣泛存在于微生物中，能夠?qū)⑵咸烟茄趸善咸烟侨┧?，廣泛應用于食品，化工，醫(yī)藥等領域。實驗室前期研究中從點青霉(Penicillium notatum)中成功克隆得到一個葡萄糖氧化酶基因，并在畢赤酵母(pichia pastoris)進行了異源表達，但是表達的水平偏低，達不到生產(chǎn)要求。
本研究通過分析影響GOD基因在畢赤酵母中表達水平的因素，發(fā)現(xiàn)該基因中存在一些畢赤
2、酵母的稀有密碼子，這可能是該基因在畢赤酵母表達量偏低的原因。本研究根據(jù)畢赤酵母密碼子使用的偏好性，并綜合考慮GOD基因的GC含量和mRNA二級結(jié)構(gòu)，對該葡萄糖氧化酶基因進行了密碼子優(yōu)化，在不改變GOD基因編碼蛋白氨基酸序列的情況下，共改變了272個堿基，涉及96個氨基酸。人工合成了葡萄糖氧化酶基因(GOD-M)，并將其克隆到表達載體pPIC9上，構(gòu)建成為畢赤酵母重組表達質(zhì)粒pPIC9-GOD-M，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母表達菌株GS115
3、，通過平板顯色的篩選方法，篩選到15株表達水平較高的重組畢赤酵母菌株，其中GOD-M33＃和GOD-M40＃重組畢赤酵母表達量最高。經(jīng)實驗室3L發(fā)酵罐誘導產(chǎn)酶120 h后，酶活力達到最高，GOD-M33＃和GOD-M40＃重組子的發(fā)酵液上清酶活分別達到365U/ml和348U/ml，分別是同等情況下原始基因畢赤酵母重組菌株表達量的2.5和2.35倍。
該酶的亞基分子量為67 kDa。酶促反應最適溫度35℃，最適pH值為6.
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