黑曲霉葡萄糖氧化酶在畢赤酵母SMD1168中的表達(dá).pdf

1、葡萄糖氧化酶是一種需氧脫氫酶，在分子氧的存在下，利用氧為電子受體，專(zhuān)一性氧化β-D-葡萄糖生成D-葡萄糖酸內(nèi)酯，同時(shí)消耗氧生成過(guò)氧化氫。葡萄糖氧化酶在生物醫(yī)學(xué)、食品工業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用，其主要分布于多種動(dòng)物、植物和微生物中，但從動(dòng)植物中獲取GOD量少且有一定的局限性，而細(xì)菌產(chǎn)的GOD也較少，最主要的生產(chǎn)菌株是黑曲霉和青霉，但黑曲霉和青霉生產(chǎn)GOD產(chǎn)量低、純化工藝繁雜，因此用基因工程方法構(gòu)建更優(yōu)良的GOD生產(chǎn)菌株一直受到高

2、度重視。
　　 巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的外源基因真核表達(dá)系統(tǒng)之一，其蛋白表達(dá)量高，且被表達(dá)的蛋白中雜蛋白少。畢赤酵母還具有能夠嚴(yán)格調(diào)控外源蛋白的表達(dá)，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行加工、折疊和翻譯后修飾，以及可將外源蛋白分泌至胞外等優(yōu)點(diǎn)。與其它真核表達(dá)系統(tǒng)相比，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)更加快捷、方便、高效。
　　 啟動(dòng)子是基因表達(dá)調(diào)控的順式作用元件，也是影響基因表達(dá)的關(guān)鍵元件。啟動(dòng)子在基因水平上的重要作用，不僅控制基因的表達(dá)水平

3、，同時(shí)也控制著基因表達(dá)的時(shí)空順序，因此啟動(dòng)子的活性很大程度上影響著基因的表達(dá)水平。而不同的啟動(dòng)子對(duì)同一種蛋白質(zhì)所表現(xiàn)出的活性也往往是不同的。所以選用合適的啟動(dòng)子對(duì)于提高基因表達(dá)水平，促進(jìn)外源蛋白在畢赤酵母中的生成是相當(dāng)重要的。質(zhì)粒pGAPZαA(3147bp)是一種表達(dá)型載體，自身攜帶3-磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動(dòng)子可在畢赤酵母中表達(dá)多種重組蛋白，這是一種組成型表達(dá)，無(wú)需其他誘導(dǎo)物。
　　 本研究利用從黑曲霉accc30161克隆

4、的GOD基因構(gòu)建了含GAP啟動(dòng)子的分泌型表達(dá)載體pGAPZα A-GOD，并在畢赤酵母 GS115、KM71和SMD1168菌株中對(duì)其進(jìn)行了表達(dá)，以期觀察GAP啟動(dòng)子對(duì)不同畢赤酵母菌株GOD蛋白表達(dá)水平的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1.黑曲霉accc30161基因組的提取以及葡萄糖氧化酶基因的擴(kuò)增與測(cè)序;
　　 2.葡萄糖氧化酶基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建及電泳、PCR、酶切、測(cè)序鑒定;
　　 3.重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)

5、化畢赤酵母SMD1168，并用PCR擴(kuò)增分析轉(zhuǎn)化結(jié)果;
　　 4.葡萄糖氧化酶SDS-PAGE蛋白電泳;
　　 5.葡萄糖氧化酶活性分析;
　　 6.溫度及培養(yǎng)基pH對(duì)畢赤酵母表達(dá)葡萄糖氧化酶的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1.測(cè)序結(jié)果顯示成功擴(kuò)增得到了黑曲霉葡萄糖氧化酶基因;
　　 2.成功構(gòu)建了葡萄糖氧化酶基因重組質(zhì)粒pGAPZαA-GOD;
　　 3.篩選得到畢赤酵母轉(zhuǎn)化子

6、SMD1168-GOD;
　　 4.SDS-PAGE蛋白電泳結(jié)果顯示葡萄糖氧化酶在畢赤酵母中得到了表達(dá);
　　 5.SMD1168-GOD表達(dá)的葡萄糖氧化酶具有活性;
　　 6.溫度及培養(yǎng)基pH顯著影響葡萄糖氧化酶在畢赤酵母中的表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 用黑曲霉accc30161的葡萄糖氧化酶基因成功構(gòu)建了葡萄糖氧化酶基因表達(dá)載體pGAPZαA-GOD。轉(zhuǎn)化后，pGAPZαA-GOD相關(guān)DNA片