米根霉脂肪酶基因的克隆、密碼子優(yōu)化及在畢赤酵母中的分泌表達(dá).pdf

1、米根霉脂肪酶具有高度的1、3位置專一性和立體選擇性，在芳香酯、生物柴油、手性化合物等有機(jī)化合物的合成中具有很高的應(yīng)用價(jià)值。利用基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)米根霉脂肪酶的異源高效表達(dá)，對(duì)該酶的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。本文以米根霉菌株 CICC3005 為出發(fā)菌株，克隆了其脂肪酶基因，通過(guò)定點(diǎn)突變和全基因合成對(duì)該基因的密碼子進(jìn)行了優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了其在畢赤酵母中的分泌表達(dá)，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了初步的酶學(xué)性質(zhì)研究。主要工作如下：
　　 (1)以總DNA基

2、因組為模板，克隆了米根霉 CICC3005 脂肪酶基因前序列(prosequence)及成熟脂肪酶基因(pro-ROL 及 mature-ROL)，并分別實(shí)現(xiàn)了其在巴斯德畢赤酵母GS115中的高效表達(dá)，其中 pro-ROL 最高酶活達(dá)到13.4 U/mL，mature-ROL 最高酶活達(dá)到 12.6 U/mL。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng) SDS-PAGE 分析，表觀分子量分別為35 kDa 及 30 kDa。對(duì)重組脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)的初步研究表明，pro

3、-ROL與 m-ROL的最適溫度均為30℃；pro-ROL的最適 pH為8.0，m-ROL的最適 pH 為9.0；以對(duì)硝基苯酚脂為底物測(cè)得 pro-ROL的最適底物為短鏈(C4)，m-ROL的最適底物為中鏈(C10)，推測(cè)重組脂肪酶分子量和酶學(xué)性質(zhì)的差異可能是由于前序列對(duì)脂肪酶的折疊和修飾的影響而導(dǎo)致。
　　 (2)以米根霉成熟脂肪酶基因 m-ROL 為出發(fā)基因，結(jié)合畢赤酵母的密碼子偏愛(ài)性，對(duì)其中的8個(gè)堿基進(jìn)行了突變替換，優(yōu)化了

4、部分密碼子，并將優(yōu)化基因?qū)氘叧嘟湍窯S115中進(jìn)行了異源表達(dá)。初測(cè)酶活表明，優(yōu)化基因的酶活高達(dá)15.5 U/mL，與出發(fā)基因相比提高了約30%。證明密碼子優(yōu)化策略可以有效的提高目的蛋白的表達(dá)量，具有一定的借鑒意義。
　　 (3)以米根霉成熟脂肪酶基因 m-ROL為出發(fā)基因，探索了通過(guò)二步法（組裝PCR-酶連法）合成全基因，并成功獲得 m-ROL基因。測(cè)序結(jié)果表明，二步法合成全基因不僅簡(jiǎn)化了合成步驟，而且大大降低了PCR 反應(yīng)過(guò)