米黑霉脂肪酶在畢赤酵母中的表達及分子改造.pdf

1、脂肪酶是重要的工業(yè)酶制劑，在食品、制藥、洗滌、合成等領域應用廣泛。米黑根毛霉脂肪酶(RML:Rhizomucormieheilipase)已經在結構分析、催化反應、工業(yè)應用等多方面得到研究。研究者在上游通過定向進化、蛋白結構分析，在下游通過發(fā)酵條件和反應條件的優(yōu)化提高RML在工業(yè)催化反應中的酶活。天然的RML包括信號肽(24個氨基酸)、前導肽(70個氨基酸)，以及成熟蛋白區(qū)(269個氨基酸)。成熟蛋白的理論相對分子質量為30KDa左右。

2、本課題的研究對象僅包括前導肽和成熟區(qū)。
　　研究表明很多蛋白酶在真核生物中表達時，一些特異性的位點會被糖基化，這些長短不一的糖鏈會影響蛋白酶的結構和活性，影響大小與糖基化的位點和糖基化程度有關。本研究將野生型RML在畢赤酵母(PichiapastorisGS115)中表達，其活性為1700U/mg蛋白，是該酶在大腸桿菌中表達的6.7倍。通過Glycomod(http://web.expasy.org/glycomod/)查詢發(fā)現R

3、ML前導肽處有兩個糖基化位點（第8位和第58位天冬酰胺），為了探索RML在畢赤酵母中表達時前導肽處的糖鏈對酶結構的影響，設計了三個去除糖基化的突變棟(M1，N8A;M2，N58A和M3，N8A和N58A)，結果證明去掉糖基化之后RML的比活是野生型的2倍，然而去掉RML前導肽位置處的糖基化卻不利于前導肽被Kex2蛋白酶切除形成成熟的蛋白，而且發(fā)現糖基化有助于RML分泌到胞外。
　　其次，將RML野生型(WT:WildType)和在

4、大腸桿菌中定向進化產生的4株酶活依次提高的突變株(G1:L57V，G2:L57V/V67A/I111T，G3:L57V/V67A/I111T/S168P，G4:L57V/V67A/I111T/S168P/S65A)基因克隆到pPIC9K中，分別構建了質粒pPIC9K-WT、pPIC9K-G1、pPIC9K-G2、pPIC9K-G3、pPIC9K-G4，經SalI線性化后轉入甲醇誘導型畢赤酵母中進行分泌表達。與大腸桿菌宿主不同，RML的4

5、個突變株在畢赤酵母中表達時，酶活性沒有呈現依次提高的趨勢。研究表明RML在大腸桿菌中定向進化的突變株不適合在真核生物中表達，這可能是因為原核生物和真核生物具有不同的蛋白翻譯、修飾、折疊體系，因此原核生物定向進化的規(guī)律不適用于真核生物。
　　然后，為了在酵母中進行RML的定向進化，首先利用α-factor和INU信號肽構建了四個菌株(α-factor+WT+pESC-URA+BY4741、INU+WT+pESC-URA+BY4741

6、、α-factor+WT+pESC-URA+EBY100、INU+WT+pESC-URA+EBY100)實現了RML在釀酒酵母中的分泌表達。但是由于在釀酒酵母中蛋白表達量和酶活力都比較低，因此以畢赤酵母為宿主，對野生型RML進行定向進化，并采用羅丹明平板法進行高通量篩選，篩選到兩個突變株8-4和8-15-1，其突變位點分別為R41C、A115V/D313E，均使酶活提高了25％左右。
　　最后，為了提高RML的發(fā)酵產量，本課題使用

7、無機鹽培養(yǎng)基采用5L發(fā)酵罐對RML進行表達。RML的生產過程分三個階段:第一階段，前40h菌體生長階段，40h之后，發(fā)酵罐內甘油消耗完全，OD600達100;第二階段，40-72h是甘油流加階段，進一步提高菌體量，并為下一步誘導做準備，此階段結束時OD600達320;第三階段，蛋白誘導階段，72h后菌體不再生長，達到穩(wěn)定期，開始進行甲醇流加誘導蛋白產生，開始誘導時甲醇流加速度為1mL/min，流加10min，2-4h之后根據需要提高甲醇