畢赤酵母中FLD1啟動子調(diào)控解脂耶氏酵母脂肪酶LIP2表達的研究.pdf

1、解脂耶氏酵母脂肪酶LIP2 (YlLIP2)是一種高活力的脂肪酶，具有重要的工業(yè)應(yīng)用前景。本文克隆了甲醛脫氫酶啟動子 (PFLD1)基因，并以pPICZαA質(zhì)粒為基礎(chǔ)構(gòu)建了帶有PFLD1啟動子和YlLIP2基因的重組質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母 (Pichia pastoris)X-33獲得重組表達菌株。搖瓶發(fā)酵篩選高脂肪酶活力的重組子，優(yōu)化重組工程菌的搖瓶發(fā)酵條件，同時在10 l發(fā)酵罐上對比了不同誘導策略對脂肪酶YlLIP2表達的影響。

2、主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　 (1)通過PCR方法從P.Pastoris GS115/pPIC9K-Lip2-HIS+中擴增得到PFLD1基因和脂肪酶YlLIP2基因。運用雙酶切將 PFLD1啟動子替代pPICZαA表達載體上的PAOX1啟動子，構(gòu)建新的表達載體pFZα，然后將脂肪酶YlLIP2基因插入該表達載體，并電轉(zhuǎn)化P.Pastoris X-33，得到重組菌P.Pastoris X-33/pFZα-Lip2。
　　

3、 (2)對重組子進行三次羅丹明B平板篩選，得到308個有橄欖油水解圈的重組子。搖瓶發(fā)酵篩選高脂肪酶活力的重組子，得到一株最高活力達672 U/ml的83＃工程菌。對83＃重組子進行了最適碳源和氮源篩選，以甲醇為碳源和誘導物，83＃重組子在誘導72 h后發(fā)酵液中酶活力為2,450 U/ml；以山梨醇和甲胺鹽酸鹽 (MA?HCl)分別作為碳源和誘導物，發(fā)酵72 h后酶活力為2,115U/ml。兩種培養(yǎng)條件下83＃重組子發(fā)酵的YlLIP2酶

4、活力分別是優(yōu)化前的3.65倍和3.15倍。檢測了83＃重組子細胞內(nèi)的脂肪酶酶活力，為147.86 U/ml，僅為發(fā)酵上清的6.4％，而野生菌株X-33胞內(nèi)只有本底酶活力7.77 U/ml。
　　 (3)10 l發(fā)酵罐上對比了MA?HCl和甲醇兩種誘導策略。MA?HCl誘導發(fā)酵用時75.34 h，最高細胞干重達59.08 g/l，最高酶活達8,400 U/ml，最高蛋白含量為2.2 g/l，最高蛋白質(zhì)比酶活達3871 U/mg；甲

5、醇誘導發(fā)酵用時146.47 h，最高細胞干重達115.73 g/l，最高酶活達15,600 U/ml，最高總蛋白質(zhì)含量達6.4 g/l，最高蛋白質(zhì)比酶活達4,075U/mg。MA?HCl和甲醇兩種誘導策略對比發(fā)現(xiàn)，前者發(fā)酵時間是后者的51.34％，單位時間發(fā)酵酶活為111.49 U/(ml·h)，而后者的為108.95U/(ml·h)；前者的單位干細胞酶活力14.79 U/mg，而后者為14.03 U/mg。前者的能耗成本比后者低大約