豬胰腺脂肪酶密碼子重組優(yōu)化、畢赤酵母高效表達及酶學(xué)特性分析.pdf

1、豬胰腺脂肪酶(PPL)是一種由449個氨基酸組成的單鏈球蛋白，分子大小在50-52kDa。豬胰腺脂肪酶作為一種內(nèi)源性的脂肪酶，能高效的將甘油三酯水解并釋放脂肪酸。在動物機體內(nèi)，飼糧中脂肪的消化吸收主要依賴于胰腺酶類。脂肪的消化對動物特別對能量要求極高的仔豬具有重要意義，因為仔豬從飼糧中獲得的能量有時不能滿足自身的需求，需要動用機體沉積的脂肪來滿足能量需求。在仔豬斷奶期間，胰腺消化酶的激活、分泌和功能尚未發(fā)育完善，特別是一些主要分解類的酶

2、如脂肪酶。在幼齡階段尤其是斷奶期間，PPL分泌不足會導(dǎo)致仔豬應(yīng)激，造成生長停頓或遲緩，造成重大的經(jīng)濟損失。商品的豬胰腺脂肪酶常用于幫助患有胰腺功能紊亂和營養(yǎng)不良的病人，幫助病人消化。但是商品豬胰腺脂肪酶主要來源于動物胰腺提取，在提取過程中會有一些其他酶類的污染。在生產(chǎn)過程中酶蛋白的提取和純化的高成本、豬胰腺組織資源有限、潛在的微生物疾病污染等因素限制了豬胰腺脂肪酶在飼料工業(yè)中的大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用。因此，有必要開發(fā)一種利用基因工程重組技術(shù)在酵

3、母表達系統(tǒng)中高效、安全表達具有天然生物學(xué)活性豬胰腺脂肪酶的方法。
　　本研究的目的是通過對豬胰腺脂肪酶(PPL)部分基因進行密碼子優(yōu)化，然后在畢赤酵母真核表達系統(tǒng)進行高效表達后，對重組蛋白進行純化，然后進行酶學(xué)活性的分析。首先根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性，人工設(shè)計并合成一段534 bp的PPL蛋白N端氨基酸（不含信號肽）編碼序列(oPPL)，然后將該片段與剩余天然PPL編碼基因序列片段進行連接，獲得全長PPL編碼序列(rePPL)，將

4、rePPL基因片段克隆到pPICZaA表達載體，構(gòu)建pPICZaA-rePPL表達載體;將構(gòu)建好的表達載體轉(zhuǎn)化入畢赤酵母X-33宿主菌中，通過甲醇對轉(zhuǎn)化子進行誘導(dǎo)表達，實現(xiàn)重組蛋白PPL在畢赤酵母真核表達系統(tǒng)中的高效表達。重組外源PPL蛋白C端含有His標簽，通過親和層析（利用Ni Sepharose High Performance層析柱）對表達蛋白進行純化，然后對重組蛋白rePPL進行酶學(xué)活性分析并與來源于豬胰腺提取的天然商品胰腺脂

5、肪酶PPL(Sigma)進行酶學(xué)特性比較。表達純化后的重組rePPL在12％ SDS-PAGE檢測顯示蛋白質(zhì)分子量為52 kDa，酶學(xué)性質(zhì)分析顯示重組PPL與天然商品PPL具有相似的酶學(xué)特性，其最適溫度為40℃，最適pH為8.0，Km值為15.4 mg/mL，Vmax為432U/mg。熱穩(wěn)定性結(jié)果顯示重組PPL不耐熱，在60℃保溫20 min后，酶活力失去80％(P＜0.05)。通過密碼優(yōu)化可以顯著提高重組rePPL表達量，與沒有密碼子