擴展青霉FS1884脂肪酶基因在畢赤酵母GS115中的表達和定向進化研究.pdf

1、脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3)，又稱三?；视王；饷?，是指分解或合成高級脂肪酸和丙三醇形成的甘油三酸酯酯鍵的酶，是催化油酯水解的一類酶的總稱。脂肪酶在自然界中來源廣泛，植物、動物、微生物中都可以產(chǎn)生脂肪酶，是最早被發(fā)現(xiàn)的酶之一。微生物脂肪酶由于來源廣泛，作用溫度和pH范圍廣，底物專一性高，是目前商業(yè)性脂肪酶的主要來源，真菌產(chǎn)生的脂肪酶是目前在工業(yè)和有機化學領域應用最多的。目前許多微生物、哺乳動物的脂肪酶基因已經(jīng)被克隆，部

2、分已經(jīng)在大腸桿菌、酵母系統(tǒng)、米曲霉等系統(tǒng)實現(xiàn)了表達?，F(xiàn)代生物技術的發(fā)展，使得人們可以從分子水平對脂肪酶進行改造。 來自擴展青霉(Penicillium expansum FS1884)的堿性脂肪酶是一種具有廣泛應用前景的脂肪酶，擴展青霉FS1884脂肪酶目前已經(jīng)在進行工業(yè)生產(chǎn)，為了獲得溫度穩(wěn)定性和酶比活提高的突變體，經(jīng)常使用誘變育種的方法得到突變體，但是傳統(tǒng)的誘變育種方法存在一定的局限性，針對以上原因，本課題首先獲得擴展青霉脂肪

3、酶基因，對其脂肪酶基因進行異源表達，并對其進行分子改造。主要研究結果如下： 提取擴展青霉Penicillium expansum FS1884總RNA，根據(jù)同一突變系譜中另一菌株PF898脂肪酶序列(GenBank NO. AF284064)設計含有BamH I、EcoRI的引物，反轉錄并擴增脂肪酶cDNA全長，雙酶切并連接到表達載體pPIC3.5k當中，構建重組脂肪酶表達載體pPIC3.5k-PEL，轉化大腸桿菌JM109，經(jīng)

4、菌落PCR初步驗證陽性克隆子后，測序驗證，cDNA全長為858bp，與預期結果相符。大量提取質(zhì)粒pPIC3.5k-PEL，使用Sal I線性化載體，電擊轉化畢赤酵母GS115，涂布于MD平板上，挑取轉化子接種于OMM和MD平板上進行陽性克隆子的選擇，并提取基因組DNA使用PCR進行進一步確認，重組脂肪酶PEL-GS在畢赤酵母GS115中得到成功表達，表達量為0.6mg/ml。橄欖油乳化液平板和NaOH滴定法鑒定重組脂肪酶活力，最適作用溫

5、度為35℃，最適pH為9.4，最高比活為2952U/mg，酶液在50℃放置30min后水解活力基本消失。 根據(jù)基因一致性原則選擇突變位點，采用一步法對脂肪酶基因進行定點誘變，共選擇8個位點進行突變，突變體脂肪酶經(jīng)電擊轉化畢赤酵母后均成功表達，其中突變體PEL-M220V-GS相對于野生型重組脂肪酶比活提高了5％，其余均有不同程度的下降，PEL-T50P-GS，PEL-L164P-GS，PEL-1102V-GS相對于野生型脂肪酶的

6、耐熱性有所提高，PEL-L164P-GS的比活雖然只有野生型重組脂肪酶的47％，但是酶的最適作用溫度提高了5℃，為40℃，其余酶的突變體耐熱性均有不同程度的下降，對突變體脂肪酶的高級結構進行模擬，并研究產(chǎn)生酶活差異的原因。 利用保真性較差的Taq DNA聚合酶，改變PCR體系成分，建立脂肪酶基因隨機突變文庫，將隨機突變脂肪酶基因轉化畢赤酵母GS115，篩選到突變株ep3，所產(chǎn)突變酶最適pH為9.4，最適作用溫度為35℃，該溫度下