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文檔簡介
1、β-半乳糖苷酶(β-Galactosidase,EC3.2.1.23),俗稱乳糖酶,是在動植物及微生物中廣泛存在的一種多功能酶,既具有水解乳糖的活性,又具有轉(zhuǎn)移半乳糖苷的活性。以乳糖為底物,能斷開乳糖分子的葡萄糖基和半乳糖基間的β-(1,4)糖苷鍵,并將游離半乳糖苷殘基連接到乳糖或葡萄糖上,形成非消化性的低聚半乳糖(Galactooligosaccharides,簡稱GOS)。目前,我國大規(guī)模生產(chǎn)中用到的β-半乳糖苷酶主要依賴于進口,所
2、以研究和開發(fā)具有優(yōu)良特性的β-半乳糖苷酶具有良好的應用前景。
從奶牛場附近土壤中篩選的草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)的β-半乳糖苷酶具有較高的水解和轉(zhuǎn)糖苷活性,但該酶是胞內(nèi)酶,不利于提取與利用。本研究將該胞內(nèi)酶在畢赤酵母GS115(Pichia pastorisGS115)中成功實現(xiàn)了分泌表達,并對重組菌的產(chǎn)酶發(fā)酵條件、酶的分離純化、酶學性質(zhì)及其應用方面進行了研究,為其工業(yè)化生產(chǎn)和應用提供一定的參考。主
3、要研究結(jié)果如下:
?。?)為獲得β-半乳糖苷酶編碼基因GalA,提取草酸青霉的RNA,利用RT-PCR技術(shù)擴增了GalA基因序列,借助于pPICZαA表達載體,將GalA基因整合至 P.pastorisGS115中,以不同濃度Zeocin篩選,篩選獲得了高拷貝數(shù)的P.pastoris GS115/pPICZαA-GalA菌株。經(jīng)SDS-PAGE分析結(jié)果顯示,重組β-半乳糖苷酶的表觀分子量為110kDa,酶活性為12.34U·mL
4、-1,表明成功構(gòu)建了P.pastoris GS115/pPICZαA-GalA菌株。
(2)單因素實驗優(yōu)化了重組菌P.pastorisGS115/pPICZαA-GalA產(chǎn)β-半乳糖苷酶的搖瓶發(fā)酵條件,在接種量為8%、初始誘導pH值為6.0、培養(yǎng)溫度為29℃、甲醇添加量為1.5%和誘導表達時間為120h的條件下β-半乳糖苷酶的表達水平為33.16U·mL-1,酶活性是優(yōu)化前的2.69倍。通過對重組菌的粗酶液分離純化,該酶最終比
5、酶活為100.31 IU·mg-1,回收率為44.1%,純化倍數(shù)是粗酶液的2.3倍。研究了重組的β-半乳糖苷酶的性質(zhì),其反應最適溫度為60℃,在溫度55℃及以下,重組酶穩(wěn)定性較好;最適pH值為5.0,且在pH值為4.5~8.5,相對酶活維持80%以上。除Cu2+與SDS對酶活性具有較強的抑制作用,其他的金屬離子和化合物對酶活性影響不明顯。該酶對鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)的Km和Vmax分別為1.32mmol·L-1和17
6、.54mmol·L-1·min-1;對乳糖的Km和Vmax分別為1.15mmol·L-1和13.38mmol·L-1·min-1。
(3)本研究將重組β-半乳糖苷酶與市售的大腸桿菌的β-半乳糖苷酶和米曲霉的β-半乳糖苷酶進行比較,在水解8 h時,重組β-半乳糖苷酶水解乳糖率為90.3%,米曲霉的β-半乳糖苷酶水解效率為75.4%,大腸桿菌的β-半乳糖苷酶水解效率為64.6%。以乳糖為底物,分別研究了初始乳糖濃度、酶的添加量和酶
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