來源于芽孢桿菌（Bacillus circulans）的β-半乳糖苷酶在畢赤酵母中的高效表達(dá).pdf

1、中國(guó)人群中有很大一部分(約75﹪~95﹪)患有乳糖不耐受癥,嚴(yán)重影響牛乳及乳制品的推廣.利用乳糖酶生產(chǎn)低乳糖乳及乳制品是解決乳糖不耐受癥問題的最佳途徑,因此,乳糖酶在食品和乳制品工業(yè)中的作用日益顯著.而生產(chǎn)乳糖酶就必須解決目前乳糖酶單位產(chǎn)量低、胞內(nèi)酶生產(chǎn)復(fù)雜、適應(yīng)范圍窄等問題,以滿足工業(yè)生產(chǎn)多方面的要求.該論文對(duì)來源于環(huán)狀芽孢桿菌Bacillus circulans的乳糖酶基因lacO進(jìn)行了優(yōu)化改造,在不改變其原有基因所編碼的氨基酸序列

2、的基礎(chǔ)上,根據(jù)畢赤酵母的密碼子選擇偏向,同時(shí)綜合在真核系統(tǒng)中影響基因轉(zhuǎn)錄、翻譯及mRNA穩(wěn)定性等因素,設(shè)計(jì)并全序列合成了適合于在畢赤酵母中高效表達(dá)的基因lacM.改造后的乳糖酶基因與原基因相比,共改變了242個(gè)堿基,涉及182個(gè)氨基酸.將合成的基因克隆到酵母表達(dá)載體pPIC9上,與酵母α-因子信號(hào)肽編碼序列以正確的閱讀框架融合構(gòu)成表達(dá)重組子pPIC9-lacM.同時(shí)將未改造的lacO也克隆到pPIC9上構(gòu)成pPIC9-lacO.將這兩個(gè)

3、表達(dá)重組子分別轉(zhuǎn)化Pichiapastoris GS115,構(gòu)建出了乳糖酶工程菌株.從166株帶有改造乳糖酶基因lacM的重組酵母中篩選到26株表達(dá)乳糖酶的重組子,在搖床水平上甲醇誘導(dǎo)144h后最高的一株的乳糖酶表達(dá)量達(dá)到2237.9U/mL發(fā)酵液.實(shí)驗(yàn)證明,重組畢赤酵母中乳糖酶基因lacM得到了高效表達(dá),表達(dá)量是朱改造基因lacO的3~5倍,表達(dá)產(chǎn)物能有效分泌且具有正常的生物學(xué)活性.說明對(duì)基因的分子改造是成功的.乳糖酶基因lacM表達(dá)