耐高溫β-半乳糖苷酶突變體的真核表達(dá)、高效制備及特性分析.pdf

1、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，EC3.2.1.23)，簡(jiǎn)稱(chēng)乳糖酶(lactase)，普遍存在于動(dòng)物組織、植物及微生物中，具有將乳糖分解為半乳糖和葡萄糖的能力，并能夠催化產(chǎn)生半乳糖寡聚體，即低聚半乳糖(Galactooligosaccharides，GOS)。目前在食品工業(yè)和市場(chǎng)上，乳糖酶的這兩個(gè)酶反應(yīng)特性具有不同的實(shí)用意義。乳糖不耐癥是一個(gè)全球普遍存在的生理性問(wèn)題，并且人們因?yàn)橹T多原因都有可能從非乳糖不耐癥的群體發(fā)展成

2、為乳糖不耐癥患者，因此無(wú)/低乳糖乳制品一直以來(lái)都受到特別的關(guān)注。另一方面，近年來(lái)國(guó)內(nèi)生活質(zhì)量的飛升，引起了多種相關(guān)疾?。ǚ逝?、三高等）高發(fā)，這些病種在國(guó)內(nèi)有上升趨勢(shì)，因此人們對(duì)膳食管理和食品安全倍加重視。研究表明GOS具有平衡腸道菌群，調(diào)節(jié)腸道酸堿度，預(yù)防便秘，改善人體腸道的生理功能，輔助鈣質(zhì)吸收，加速脂肪代謝，保護(hù)肝臟功能等多種特質(zhì)，這使得GOS這種新型的天然食品添加劑有了廣闊的市場(chǎng)空間。而這些方向都是乳糖酶可能涉及的市場(chǎng)和工業(yè)領(lǐng)域。

3、國(guó)內(nèi)對(duì)于乳糖酶耐高溫性質(zhì)和乳糖酶水解方向的研究較多，但對(duì)于GOS合成方向的研究剛剛起步。這些研究中，活性中心單個(gè)位點(diǎn)的氨基酸對(duì)整個(gè)乳糖酶雙向性質(zhì)影響的研究很少。國(guó)際上研究也比較少，只有少數(shù)科學(xué)家在做這方面相關(guān)的研究。因此在基于位點(diǎn)變化而影響乳糖酶分解能力或合成能力的研究上還有很大的空間。
　　本研究通過(guò)點(diǎn)突變使β-半乳糖苷酶[Pyrococcus furiosus DSM3638]415位天冬酰胺(Asn or N)突變?yōu)榻z氨酸(

4、Ser or S)，突變體構(gòu)建于巴斯德畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒載體，通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法把此線性化的重組質(zhì)粒整合入巴斯德畢赤酵母細(xì)胞中，經(jīng)藥物篩選獲取單克隆的細(xì)胞株，用以發(fā)酵表達(dá)進(jìn)而制備β-半乳糖苷酶的突變體酶。結(jié)果表明，該突變體所產(chǎn)的β-半乳糖昔酶在95℃、pH=5.5時(shí)酶活力達(dá)到最高，為耐高溫乳糖酶;該乳糖酶的熱穩(wěn)定性良好，100℃加熱1h條件下，幾乎不影響該乳糖酶的活性;該突變體酶在低溫儲(chǔ)存環(huán)境下活性也十分穩(wěn)定;研究表明，該突變體酶水解牛奶的

5、能力較好，可用于低乳糖牛奶及其相關(guān)制品加工中;突變后β-半乳糖苷酶的另一個(gè)方面的特性，即產(chǎn)生低聚半乳糖的能力的也有所提高，但不夠明顯，低于可工業(yè)化的水平。因此該突變株所產(chǎn)的乳糖酶可用于乳制品的加工行業(yè)，但不能期盼產(chǎn)生更多的半乳糖寡聚體。同時(shí)研究通過(guò)中試級(jí)別乳糖酶生產(chǎn)發(fā)現(xiàn)該乳糖酶的表達(dá)活力隨菌體密度的增加而上升，這對(duì)于該菌株用于工業(yè)生產(chǎn)乳糖酶及后期純化十分有利。由研究可推測(cè):源自Pyrococcus furiosus DSM3638的乳糖