蜂毒肽與基因變構(gòu)IL-2融合蛋白在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)及生物學(xué)活性研究.pdf

1、目的：構(gòu)建融合基因蜂毒肽(melittin)與人變構(gòu)白介素-2[M-IL-2(88Arg,125Ala)]表達(dá)載體，驗(yàn)證構(gòu)建成功后將重組基因轉(zhuǎn)染進(jìn)宮頸癌HeLa細(xì)胞，神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞，檢測(cè)融合基因[M-IL-2(88Arg,125Ala)]在這兩種細(xì)胞中的表達(dá)以及檢測(cè)重組蛋白對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞，神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的影響，為蜂毒肽和白介素2在腫瘤方面的基因治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，并在引物上添加相應(yīng)的

2、酶切位點(diǎn)，以pPICZαA/M-IL-2(88Arg,125Ala)為模板，使用PCR方法，獲得實(shí)驗(yàn)所需要的M-IL-2目的片段。以pLEGFP-C1和pEGFP-N3為載體構(gòu)建M-IL-2融合基因的真核表達(dá)載體pLEGFP-C1-M-IL-2(88Arg,125Ala)，pEGFP-N3-M-IL-2(88Arg,125Ala)。使用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，采用雙酶切和DNA序列的方法鑒定重組質(zhì)粒，鑒定成功后，使用Lipofect

3、amine2000脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)宮頸癌HeLa細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87中。M-IL-2融合蛋白在宮頸癌HeLa細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中的表達(dá)采用RT-PCR及Western blot的方法進(jìn)行檢測(cè)，表達(dá)驗(yàn)證成功后使用CCK-8的方法及流式細(xì)胞儀檢測(cè)融合蛋白的生活學(xué)活性，檢測(cè)其對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖和凋亡的影響。
　　結(jié)果：重組質(zhì)粒pLEGFP-C1-M-IL-2(88Arg,125Ala)，p

4、EGFP-N3-M-IL-2(88Arg,125Ala)經(jīng)過酶切及DNA測(cè)序證實(shí)構(gòu)建成功，經(jīng)過RT-PCR及 Western blot檢測(cè)證實(shí)重組基因 M-IL-2(88Arg,125Ala)可在宮頸癌細(xì)胞HeLa，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87中表達(dá)，經(jīng)過CCK-8實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞流式儀分析融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)對(duì)以上兩種腫瘤細(xì)胞的增殖具有一定的抑制作用。
　　結(jié)論：真核表達(dá)載體 pLEGFP-C1-M-IL-2(88Arg,125Ala)，p