白喉毒素-IL-2融合蛋白的基因構(gòu)建及其表達(dá)、純化的研究.pdf

1、東南大學(xué)碩L學(xué)位論文摘要1喉毒素(DiphthreiatoxinDT)是由感染0噬菌體的白喉?xiàng)U菌所產(chǎn)生的外毒素，毒性極強(qiáng)，它通過滅活真核細(xì)胞的肚鏈延伸因子II，阻斷蛋白合成，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。近年來白喉毒素被廣泛用于制備各種腫瘤導(dǎo)向藥物。白細(xì)胞介素2(1L2)主要由T細(xì)胞或T細(xì)胞系產(chǎn)生?，F(xiàn)己證明。許多血液系統(tǒng)惡性腫瘤細(xì)胞，如成人T細(xì)胞白血病、毛細(xì)胞白血病、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤等，表達(dá)高親和力IL2受體，且表達(dá)量顯著高于正常細(xì)胞。這種IL2受體的

2、顯著差異及受體與配體的特異性結(jié)合，為殺傷腫藥物的定向?qū)胩峁┝丝赡?。崢于上述機(jī)理)我們構(gòu)建了DT3s9IL2重組嵌合毒素，它保留了白喉毒素N端的389個氨基酸(跨膜區(qū)和酶活性區(qū))，用人全長IL2替換了白喉毒素受體結(jié)合區(qū)。依賴于白喉毒素蛋白分子結(jié)構(gòu)上的特點(diǎn)，重組嵌合毒素DT3s9IL2包括三個有活性的功能區(qū)。即白喉毒素酶活性區(qū)、跨膜區(qū)及人IL2。其作用機(jī)制是分子中的IL2與細(xì)胞表面的IL2受體特異性結(jié)合，形成受體一配體復(fù)合物，然后通過跨膜

3、區(qū)結(jié)構(gòu)的改變來介導(dǎo)毒素內(nèi)化，內(nèi)化后的毒素蛋白分子，在胞內(nèi)酸性環(huán)境的作用下發(fā)生斷裂，釋放白喉毒素酶活性區(qū)至胞漿中發(fā)揮毒性作用，從而特異性地殺滅IL2高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞。乙實(shí)驗(yàn)首先應(yīng)用PCR技術(shù)分別擴(kuò)增編碼白喉毒素N端389個氨基酸的DNA片段(DT3s9)和人白細(xì)胞介素2全長編碼基因:將PCR擴(kuò)增的目的基因產(chǎn)物分別克隆到pUC18載體上，再用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶NdeISph1BamHI等切下，將它們拼接到pET3a原核表達(dá)載體上，得到pET

4、3aDT389IL2，測定基因序列正確。隨后，用pET3aDT3s9IL2原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，用IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)。確定蛋白表達(dá)的最適條件為:37℃培養(yǎng)至OD600約0.6，加入IPTG至終濃度為1mmoUL，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)35h。傳代100代篩選出穩(wěn)定表達(dá)株，表達(dá)量17%以上，經(jīng)超聲破菌及SDSPAGE電泳確定目的蛋白為可溶性表達(dá)。經(jīng)SDSPAGE電泳鑒定了目的蛋白的分子量為58kD，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。Wes

5、temblot表明目的蛋白與白喉毒素多克隆抗體及人IL2多克隆抗體均有很好的免疫反應(yīng)性，證明其中同時含有白喉毒素和人IL2成分，確認(rèn)其為DTvsvIL2東南大學(xué)碩士學(xué)位論文ABSTRACTDiphtheriatoxin(DT)isasinglechainexotoxinof535amionacidssecretedbycorynebacteriophagediphtheriaecarryingDTgene.Ithasstrongtoxi

6、cityandonlyoneortwomoleculescankillacell.Sothetoxinarewidelyusedinthestudiesontargetingdrugs.Inlertenkin2(IL2)isapleiotropiccytokinewhichmainlybesecretedbyTcelllymphocytes.Onthecellsurfaceofsometumorssuchaschroniclymphoc

7、yticleukaemiacutaneousTcelllymphoma(CTCL)thereceptorsofIL2havebeendemonstratedbeingataveryhighlevel.ForthisreasonselectivecytotoxicityagainstIL2receptorbearingcellscouldbeusefulintumortargetingtherapy.Basedonthisstrategy

8、weconstructedachimericmoleculefusingIL2withtheenzymaticdomainandtransmembranedomainofDT(namedDT389).ThemechanismbywhichDT389IL2killacellisthatonceIL2moleculesbindtotheirreceptorsoncellsurfacethetransmembranedomainwilltra

9、nslocatetheenzymaticdomainintothecytoplasm.ThentheenzymaticdomaincatalysesthetransferoftheADPrebosylgroupofNADtoelongationfactor2(EF2)asaconsequenceEF2isinactivatedandtheproteinsynthesisofthesensitivecellisheldbackTomake

10、thehybridmoleculeofDT389IL2thefragmentsofbothtruncateddiphtheriatoxin(containingthe389aminoacidsofNterminusDT389)andfulllengthhumanIL2geneswereamplifiedbypolymerasechainreaction(PCR)proceduresrespectivelyandthenwereclone

11、dseparatelyintopUC18vector.Afteridentificationbyrestrictenzymem叩pingandsequencingDT389andIL2cDNAwerelinkedtogetherandtheninsertedintoprokaryoticexpressionvectorpET3atheresultedvectorwasnameaspET3aDT3s91L2.SecondlythepET3

12、aDT3s9IL2wastransformedintoEcolistrainBL21(DE3).RecombinantDT389IL2wasexpressedsuccessfullyusingIPTOtoinducethetranscriptionT7promoterstheexpressionlevelcouldreachup18%ofthetotalbacterialprotein.AspredictedSDSPAGEanalysi