抗ErbB2 scFv-Fc-IL-2融合蛋白的構(gòu)建、表達(dá)及其功能的初步研究.pdf

1、重組抗體與細(xì)胞因子的融合蛋白結(jié)合了抗體獨(dú)特的靶向功能和細(xì)胞因子的多功能活性，被稱為免疫細(xì)胞因子(Immunocytokines，ICK)，臨床前研究結(jié)果顯示其良好的應(yīng)用前景。本研究采用基因工程方法構(gòu)建了抗人ErbB-2 scFv-Fc-IL-2融合蛋白(HFI)，并對其抗原結(jié)合特性、IL-2生物學(xué)活性及體內(nèi)外殺傷ErbB-2過表達(dá)腫瘤細(xì)胞的功能進(jìn)行了初步研究。本研究分三個部分。 1、抗人ErbB-2 scFv-Fc-IL-2融合

2、基因的構(gòu)建及表達(dá) 采用基因工程技術(shù)將鼠抗人ErbB-2單鏈抗體(scFv)基因、人IgG1 Fc段基因以及人IL-2基因融合，插入質(zhì)粒pCI/dhfr，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pCI/HFI。以此載體轉(zhuǎn)化CHO細(xì)胞，分別用夾心ELISA法、細(xì)胞ELISA法、流式細(xì)胞術(shù)及MTT等方法檢測轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清中融合蛋白的活性。構(gòu)建的融合蛋白被命名為HFI，HFI能被抗人IgG及抗人IL-2抗體所識別，能與高表達(dá)ErbB-2的SKBR3細(xì)胞

3、特異性結(jié)合，并能促進(jìn)IL-2依賴細(xì)胞系CTLL-2細(xì)胞增殖，即HFI保留了識別ErbB-2抗原的能力及IL-2的生物學(xué)活性。經(jīng)質(zhì)譜分析證明HFI的實(shí)際蛋白序列與理論設(shè)計(jì)一致。 2、利用兩階段培養(yǎng)方法提高HFI在CHO細(xì)胞中的表達(dá) 采用基因工程技術(shù)刪除載體內(nèi)SV40啟動子中72 bp的增強(qiáng)子序列，以弱化二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase dhfr)。用改構(gòu)后的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，加壓篩選，獲

4、得了穩(wěn)定表達(dá)HFI的工程細(xì)胞株。HFI的表達(dá)水平由最初的100 ng/ml提高到25μg/ml。通過優(yōu)化工程細(xì)胞培養(yǎng)溫度和兩階段培養(yǎng)策略，HFI表達(dá)水平得到進(jìn)一步提高(60-80 μg/ml)。同時，較為系統(tǒng)地研究了降低培養(yǎng)溫度對工程細(xì)胞增殖、細(xì)胞活力、凋亡、細(xì)胞周期及對HFI表達(dá)水平和生物學(xué)活性的影響。結(jié)果顯示，降低培養(yǎng)溫度可增強(qiáng)細(xì)胞活力，減少細(xì)胞凋亡，而不影響HFI的生物學(xué)活性。本部分研究通過優(yōu)化表達(dá)載體和工程細(xì)胞培養(yǎng)方案，有效地提