SLC-anti CEA ScFv雙功能抗體融合蛋白的構(gòu)建與表達(dá).pdf

1、外周淋巴組織趨化性細(xì)胞因子(SLC)具有趨化T細(xì)胞和成熟樹(shù)突狀細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞的能力,并可引發(fā)T細(xì)胞歸巢,具有確定的依賴(lài)T細(xì)胞的抗腫瘤作用.癌胚抗原CEA(carcinoembryonic antigen)是一種廣譜腫瘤標(biāo)志物,在惡性腫瘤的鑒別診斷,病情監(jiān)測(cè)等方面有著重要的臨床價(jià)值,是腫瘤治療理想的靶抗原,抗CEA抗體作為導(dǎo)向藥物載體,攜帶具有細(xì)胞殺傷活性的同位素、化療制劑、毒素、藥物前體,進(jìn)行腫瘤導(dǎo)向治療有著廣泛的應(yīng)用前景.細(xì)胞因子-

2、抗體融合蛋白可以在體內(nèi)有效的將細(xì)胞因子定位到表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原的腫瘤細(xì)胞處,在腫瘤的治療中已成為一種有效的靶向性策略,此融合蛋白將腫瘤抗體分子的特異性與細(xì)胞因子的多能性很好的保留了下來(lái).該實(shí)驗(yàn)室利用基因工程技術(shù)將編碼SLC和抗CEA單鏈抗體的核苷酸序列克隆至經(jīng)改變多克隆位點(diǎn)序列而適合表達(dá)雙特異抗體的載體pALM中,成功構(gòu)建了雙功能抗體融合蛋白分子.該研究在此基礎(chǔ)上,在重組表達(dá)載體pALMSLC-anti CEA ScFv上,PCR擴(kuò)增出雙

3、功能分子SLC-anti CEA ScFv的編碼序列,經(jīng)酶切處理后,分別克隆至同樣經(jīng)酶切處理的載體pTMF和pTFRSM中,PCR和測(cè)序鑒定結(jié)果表明,成功構(gòu)建了重組表達(dá)載體pTMF SLC-anti CEA ScFv和pTFRSM SLC-anti CEA ScFv.SDS-PAGE和Western blotting分析結(jié)果表明目的蛋白SLC-anti CEA ScFv在各載體中均獲得特異表達(dá),分別從不同的誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間、溫度等方面摸索了

4、SLC-anti CEAScFv在不同載體中的表達(dá)條件,結(jié)果顯示,該融合蛋白SLC-anti CEA ScFv在P<'ALM>中的表達(dá)量最高,主要以包涵體的形式存在,而在載體P<'TFRSM>中的表達(dá)產(chǎn)物主要以可溶形式存在,證明了分子伴侶FkpA可以顯著提高目的蛋白的可溶性表達(dá).表達(dá)產(chǎn)物采用鎳離子螯合層析法進(jìn)行了純化,純化率達(dá)到了95%.在獲得了純化的SLC-anti CEA ScFv的樣品后,首先采用ELISA法對(duì)其抗原結(jié)合活性進(jìn)行了

5、測(cè)定,以O(shè)D490比陰性對(duì)照高出2.5倍為活性合格的標(biāo)準(zhǔn).結(jié)果顯示,SLC-anti CEA ScFv與T細(xì)胞Jurkat細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞SW116均有較高的結(jié)合活性.說(shuō)明它具有較好的靶向性和特異性.在此基礎(chǔ)上,對(duì)活性合格樣品進(jìn)行了趨化活性的研究,結(jié)果也比較理想,在以外周血淋巴細(xì)胞為計(jì)數(shù)細(xì)胞時(shí),該融合蛋白表現(xiàn)出明顯的趨化作用,其濃度為0.225 ug/ml-1.65ug/ml時(shí)對(duì)淋巴細(xì)胞的趨化指數(shù)最高.趨化實(shí)驗(yàn)和ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示我