融合基因anti-erbb2 scfv-fc-cd28-cd3(ζ)的構(gòu)建及真核表達(dá)

1、1融合基因融合基因antierbB2scFvFcCD28CD3(ζ)的構(gòu)建的構(gòu)建及真核表達(dá)及真核表達(dá)1隋文君蘇世振胡望雄李紅智布立敬(溫州醫(yī)學(xué)院浙江省重點(diǎn)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室溫州325035)摘要摘要本研究利用SWISSMODEL預(yù)測該融合蛋白的三級結(jié)構(gòu)。利用PCR的方法分別從重組pPIC9k、重組pBullet和pSecTag2B上擴(kuò)增出3段基因片段，即片段antierbB2scFv(簡稱A)、片段FcCD28CD3(ζ)(簡稱B)和信號

2、肽序列(簡稱S)。利用SOEPCR將3段序列連接形成融合基因片段SAB。經(jīng)TA克隆擴(kuò)增及鑒定后，將融合基因片段與逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pLNCX相連構(gòu)建重組真核表達(dá)載體，電轉(zhuǎn)染人淋巴瘤T細(xì)胞株Jurkat，G418篩選后用流式細(xì)胞術(shù)檢測融合蛋白穩(wěn)定表達(dá)情況。經(jīng)預(yù)測在antierbB2scFv與Fc基因片段之間不加連接肽的融合蛋白，在三級結(jié)構(gòu)上可形成更佳的功能構(gòu)象。經(jīng)PCR、酶切及測序鑒定均證實(shí)成功構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pLNCXSAB(在A與

3、B基因片段之間不加linker)。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測，在轉(zhuǎn)染的Jurkat細(xì)胞中融合蛋白表達(dá)率約為56.17%。本研究應(yīng)用分子克隆的方法成功地構(gòu)建了重組真核表達(dá)載體pLNCXantierbB2scFvFcCD28CD3(ζ)，融合基因能夠在淋巴瘤T細(xì)胞株中表達(dá)，為制備含該融合基因的原代T淋巴細(xì)胞，進(jìn)行erbB2過表達(dá)腫瘤的靶向基因治療研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞關(guān)鍵詞erbB2融合基因表達(dá)載體腫瘤治療HER2cerbB2是編碼一種生長因子受

4、體(HER2cerbB2受體)的癌基因。HER2作為一種重要的腫瘤相關(guān)抗原，在腫瘤靶向治療中倍受關(guān)注[1]。目前，在以HER2為靶向靶點(diǎn)的抗腫瘤治療研究中，以單克隆抗體Herceptin應(yīng)用最為廣泛。但對Herceptin進(jìn)行的臨床實(shí)驗(yàn)證明，其有效率較低。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用基因工程的方法對抗erbB2單鏈抗體可變區(qū)基因(scFv)進(jìn)行改造，構(gòu)建融合基因antierbB2scFvFcCD28CD3(ζ)，不僅保留抗原結(jié)合特異性，增收稿日期:201

5、00705接受日期:20100913浙江省自然科學(xué)基金(No.Y205171)和溫州市科技局對外合作項(xiàng)目(No.H20080059)通訊作者。Tel:057786699656Email:wzmclhz@.cn3Table1Primersfamplifyingthreegenefragments(regularPCRSOEPCR5’3’)FragmentsPrimersTm(℃)SABSF：GCTGGAAGCTTAGCATGGAGACAG

6、ACACACSR：GTCAGCACAATGTCGTCACCAGTGGAACCTAF：CTGGTGACGACATTGTGCTGACCCAAACTAR：TCGGCTGACGAGACGGTGACTGAGGTTBF：CCGTCTCGTCAGCCGAGCCCAAATCTCCTBR：AACCATCGATCAGCATCTCTCCAGTATTAGCG67.5067.5066.2768.0870.5167.33Theundersceswerethesit

7、esfrestrictiondigestthegreyhighlightedsequenceswerecomplimentarytailersequencesthedottedsequenceswerestartterminationcodons.SFARwereusedasprimersfamplifyingSAfragmentinSOEPCRSFBRwereusedasprimersfamplifyingSABfragmentinS

8、OEPCR.應(yīng)用高保真PyrobestTaq分別從pSecTag2、重組pPIC9K和重組pBullet上普通PCR擴(kuò)增3段目的基因片段S、A和B(PCR反應(yīng)程序見表2)。經(jīng)電泳鑒定后，回收目的片段。Table2PCRprocedurefamplifyingthreegenefragments(SAB)FragmentsPCRproceduresS94℃5min94℃30s59℃30s72℃45sec30cycles72℃5minA94

9、℃5min94℃30s58℃45s72℃1min30cycles72℃8minB94℃5min94℃30s59℃45s72℃2min30cycles72℃8min用高保真PyrobestTaq進(jìn)行SOEPCR先將片段S與片段A相連得片段SA，經(jīng)電泳鑒定后回收，之后再用ExTaq進(jìn)行SOEPCR將片段SA與片段B相連得融合基因片段SAB，并且在SAB尾端帶上堿基A方便下一步進(jìn)行TA克隆，經(jīng)電泳鑒定后回收。實(shí)驗(yàn)中SOEPCR的反應(yīng)條件為94

10、℃5min；94℃30s，55℃1min，72℃2.5min，30個循環(huán)；72℃8min。1.2.4融合基因的TA克隆、轉(zhuǎn)化及鑒定按照pMD19SimpleT載體使用說明進(jìn)行TA克隆，將融合基因轉(zhuǎn)化、篩選、培養(yǎng)后提取質(zhì)粒DNA，并進(jìn)行電泳、酶切、測序鑒定。1.2.5重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化及鑒定分別對逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pLNCX和重組pMD19SimpleT載體，用HindⅢ和ClaⅠ進(jìn)行雙酶切，回收純化融合基因片段和pLNCX載體片段