anti-CD20scFv-IgGFc-ζ載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染人類外周血T淋巴細胞.pdf

1、溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文antiCD20scFvIgGFcζ載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染人類外周血T淋巴細胞姓名：蔣龍翔申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：血液內(nèi)科指導(dǎo)教師：俞康吳建波20060301攔w醫(yī)學(xué)院填￡Ⅱ詫文濃度800ug／ml篩選兩周后，篩選出陽性的細胞克隆，經(jīng)PCR反應(yīng)粗略的檢剎載體轉(zhuǎn)染結(jié)果，并用流式檢測‘鏈的表達情況如表達陽性，可用N[H3T3細胞系測定病毒滴度，病毒滴度高的包裝細胞吣17可以用于下一步外周血T細胞的轉(zhuǎn)染。3、外周血T細胞的分離

2、和轉(zhuǎn)染：從健康入抽取外周血10ml，使用Ficoll分離液做密度梯度離心法，分離的外周血T細胞接種在培養(yǎng)瓶里r培養(yǎng)條件為lO％胎牛血清的R孫1】64037“(2的％培養(yǎng)箱中加入5萬ⅣⅢ1的IL_2藥液為12n1，使其雖終濃度一直維持在50U／田l，同時加入lmg／Ⅲ1的pHA—L為2“1t使其終濃度為lpg／ml，并加入DRf33Dng／ml，共刺激三天，流式細胞術(shù)檢涮CD3陽性的細胞，待陽性選到90％阻上時，進行下一步的細胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染

3、后用流式術(shù)檢測載悻在T細胞上的表達情況結(jié)果，1、重組逆轉(zhuǎn)錄病毒袁迭載悻pL聃aⅫ鋤20蚓Pvn90Fc，‘成功構(gòu)建，經(jīng)菌蓓PCR，內(nèi)切酶鑒定祈步篩選出成功的重組載體，2、目的基茵片斷可阻表達在PA317包裝細胞上，在經(jīng)G418篩選獲得大量穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的PA317細胞經(jīng)PCR和流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染的結(jié)果。包裝細胞PA317可以產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)染病毒可咀進一步轉(zhuǎn)染補周血T細胞，并在其表面穩(wěn)定表運，為以后篩選合適的特異針對C020陽性濰巴瘤

4、靶向治療的基因重組T細胞打下堅實的基礎(chǔ)。結(jié)論：l、通過分子克隆成功的構(gòu)建aatiCD20scFv／【gGFd‘逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，為轉(zhuǎn)染真核細胞創(chuàng)造了條件2、真棱表達載俸anfiCD20scFvflgGFd‘船眵表達在pA317細胞包裝細胞，并且可以產(chǎn)生較高的病毒滴度，成功地轉(zhuǎn)染外周血T細胞構(gòu)建了針對C020陽性淋巴癌靶向治療的基西重組T細胞，為CD20陽性淋巴瘤的特異性生物治療創(chuàng)造條件。關(guān)鍵詞：TCR／CD3復(fù)合物基因重組逆轉(zhuǎn)錄病毒CD2