CD28分子的克隆表達(dá)及CD28核糖體單鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建.pdf

1、本研究旨在應(yīng)用核糖體展示技術(shù)篩選出與人的CD28分子特異性結(jié)合的單鏈抗體,以期CD28單抗能更好的應(yīng)用于腫瘤的免疫治療。
　　 首先,從Jurkat細(xì)胞中得到CD28分子的基因,經(jīng)過酶切連接入表達(dá)載體pET28并進(jìn)行原核表達(dá)。
　　 以原核表達(dá)純化的重組CD28蛋白抗原免疫Balb/c小鼠,每隔兩周免疫一次,共免疫4次。免疫后,取小鼠脾臟并分離總RNA,設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,PCR擴(kuò)增小鼠重鏈可變區(qū)VH和輕鏈

2、可變區(qū)κ。通過重疊延伸PCR,經(jīng)linker DNA連接形成抗CD28單鏈抗體庫(kù)。
　　 從構(gòu)建的抗CD28單鏈抗體庫(kù)中,應(yīng)用核糖體展示技術(shù)篩選抗CD28的單鏈抗體。所構(gòu)建的單鏈抗體庫(kù),經(jīng)過體外轉(zhuǎn)錄翻譯后,形成“單鏈抗體—核糖體-mRNA”三元復(fù)合物,并以此進(jìn)行體外篩選。先以His蛋白負(fù)篩,再以CD28為抗原進(jìn)行篩選。經(jīng)過三輪篩選,RT-PCR擴(kuò)增單鏈抗體片段,并連接到pET43.1a表達(dá)載體中。轉(zhuǎn)化E.coli DH5a,挑取