B7-H4的克隆表達(dá)及抗B7-H4核糖體展示單鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建及抗體篩選.pdf

1、目的：本研究旨在構(gòu)建抗人B7-H4單鏈抗體庫(kù)，并利用核糖體展示技術(shù)篩選出高特異和高親和性的鼠源抗人B7-H4單鏈抗體;以期抗B7-H4單鏈抗體能更好的應(yīng)用于腫瘤的預(yù)防與免疫治療中。
　　方法：從培養(yǎng)的人A549細(xì)胞中獲得總RNA，利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出B7-H4胞外區(qū)基因，通過(guò)雙酶切技術(shù)，將該基因插入原核表達(dá)載體pET-28a(+)中進(jìn)行原核表達(dá)。
　　將得到的B7-H4胞外區(qū)蛋白純化，作為抗原用于免疫Balb/c小鼠，

2、每?jī)芍苊庖咭淮危裁庖?次，免疫結(jié)束后，從免疫小鼠的脾臟中提取總RNA，并設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用PCR技術(shù)合成小鼠的VH-linker和Vκ-linker序列，通過(guò)SOE-PCR技術(shù)將二者連接得到產(chǎn)物VH/Vκ，將其插入pUM-19T載體并轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α，并用菌落PCR技術(shù)進(jìn)行鑒定和測(cè)序分析。
　　通過(guò)核糖體展示技術(shù)從已構(gòu)建的抗B7-H4單鏈抗體庫(kù)中篩選出抗B7-H4單鏈抗體。將已構(gòu)建成功的抗B7-H4

3、單鏈抗體庫(kù)經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄翻譯，形成“單鏈抗體-核糖體-mRNA”三元復(fù)合物，繼而用于進(jìn)行體外篩選。先用His蛋白負(fù)篩，再用B7-H4蛋白為抗原正篩，進(jìn)行三輪篩選后，利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增目的單鏈抗體基因片段，插入原核表達(dá)載體pET-43.1a(+)，轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α，并用菌落PCR技術(shù)鑒定和測(cè)序分析。將測(cè)序正確的陽(yáng)性重組子轉(zhuǎn)化至Ecoli BL21(DE3)中，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)原核表達(dá)。
　　將經(jīng)鎳柱親和純化后的單鏈抗

4、體蛋白進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，從而篩選出一株高效表達(dá)目的蛋白的具有高特異性親和力的單鏈抗體，并用Western blotting進(jìn)一步檢測(cè)其特異性。
　　結(jié)果：克隆表達(dá)出了B7-H4胞外區(qū)蛋白，大小為27 kDa，構(gòu)建的核糖體展示庫(kù)中重鏈為439 bp、輕鏈為680 bp，VH/Vκ為1098bp，篩選出的scFv蛋白大小約為110 kDa，與B7-H4具有高親和力和特異性。
　　結(jié)論：本研究獲得了人B7-H4胞外區(qū)重組蛋白