鼠抗人B7-H4單克隆抗體的制備及可溶性B7-H4酶聯(lián)檢測試劑盒的研制.pdf

1、B7-H4(B7x，B7S1)是B7家族的新成員，可以通過抑制T細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子的產(chǎn)生及阻遏細(xì)胞周期進(jìn)程發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用。人B7-H4位于1號染色體上，cDNA長約1.8kb，在基因組上跨越66kb，含有6個外顯子和5個內(nèi)含子，編碼282個氨基酸，屬于免疫球蛋白超家族。人B7-H4分子的mRNA在淋巴和非淋巴組織中都有表達(dá)，但免疫組化顯示，B7-H4蛋白僅在部分正常組織中微弱表達(dá)。近年來許多研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)B7-H4蛋白在多種腫瘤組織中異

2、常表達(dá)，如卵巢癌、乳腺癌、肺癌等，這提示了B7-H4分子可能在腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)攻擊中發(fā)揮一定的作用，此外B7-H4在維持機(jī)體免疫耐受過程中也起到重要的作用。因此，B7-H4分子的作用為腫瘤、自身免疫性疾病和移植排斥反應(yīng)等疾病提供了新的治療思路。阻斷B7-H4分子與其受體的相互作用，有望成為干預(yù)自身免疫性疾病和腫瘤生物治療的潛在靶點。制備特異性鼠抗人B7-H4單克隆抗體及研制特異、靈敏、穩(wěn)定的人可溶性B7-H4酶聯(lián)檢測試劑盒，為進(jìn)

3、一步研究B7-H4在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用提供了有力的工具，同時也為臨床相關(guān)疾病的診斷、治療提供了新的手段。
　　 一、鼠抗人B7-H4單克隆抗體的制備及其生物學(xué)特性的初步研究
　　 [目的]：制備鼠抗人B7-H4的單克隆抗體(mAb)并對其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定。
　　 [方法]：以本室構(gòu)建的穩(wěn)定高表達(dá)B7-H4分子的L929/B7-H4基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞為免疫原，免疫6～8周齡的BALB/c小鼠，取小鼠脾臟細(xì)胞與小鼠骨髓

4、瘤細(xì)胞(SP2/0)融合后，采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)篩選陽性克隆，制備穩(wěn)定分泌抗B7-H4mAb的細(xì)胞株，用快速試紙法鑒定mAb的Ig亞類，并采用Westernblot、Dotblot、位點競爭抑制實驗和T細(xì)胞增殖抑制阻斷實驗對所獲的mAb進(jìn)行鑒定。
　　 [結(jié)果]：成功獲得3株穩(wěn)定分泌抗人B7-H4mAb的陽性克隆，分別命名為5C8、5G3、8F10。快速試紙法鑒定5C8為IgG2a類、5G3和8F10均為IgG1類。West

5、ernblot和Dotblot結(jié)果表明:5C8、5G3、8F10均能與人B7-H4蛋白特異性結(jié)合;位點競爭實驗顯示(1):3株單抗與商品化單抗H74結(jié)合在不同位點;(2):與本室已有的2株單抗1F10和2B2位點競爭結(jié)果為:3株單抗與1F10結(jié)合在不同位點;5C8和5G3與2B2識別位點可能相近，8F10與單抗2B2結(jié)合在不同位點;(3):這3株單抗相互位點競爭結(jié)果為:5C8與5G3結(jié)合在不同位點;8F10與5C8和5G3識別位點可能相

6、近。T細(xì)胞增殖抑制阻斷實驗顯示，這3株單抗均能阻斷B7-H4分子對T細(xì)胞增殖抑制作用。
　　 [結(jié)論]：成功獲得3株鼠抗人B7-H4單克隆抗體，為研究B7-H4分子在腫瘤中的作用提供了手段。
　　 二、可溶性B7-H4酶聯(lián)檢測試劑盒的研制
　　 [目的]：建立人可溶性B7-H4(sB7-H4)酶聯(lián)檢測試劑盒。
　　 [方法]：以本研究已獲得的3株單抗(5C8、5G3、8F10)和本室已獲得的另外2株鼠抗人

7、B7-H4單抗(1F10、2B2)為基礎(chǔ)，采用單抗1F10作為包被抗體，以標(biāo)記生物素(biotin)的單抗8F10作為檢測抗體，建立雙單抗夾心的人可溶性B7-H4(sB7-H4)酶標(biāo)檢測方法，并對正常人外周血血清中的sB7-H4含量進(jìn)行了檢測。
　　 [結(jié)果]：成功研制了人sB7-H4酶聯(lián)檢測試劑盒，其靈敏度為3.13ng/mL。該試劑盒4℃放置1個月，離散度(CV％)＜±2.80，回收率為92.98％～107.4％，提示該檢測