人B7-H4-Fc融合蛋白的制備及B7-H4受體表達(dá)的檢測.pdf

1、B7-H4分子是近年新發(fā)現(xiàn)的一個B7家族成員，其與受體結(jié)合后通過抑制ERK、JNK、p38、AKT等分子的活性，進(jìn)而抑制T細(xì)胞的增殖、活化和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，發(fā)揮其負(fù)性調(diào)節(jié)的作用。人B7-H4分子定位于人染色體1p11.1，由6個外顯子和5個內(nèi)含子組成，其mRNA在淋巴和非淋巴組織中呈廣泛性表達(dá)，但由于受到轉(zhuǎn)錄后水平的嚴(yán)格調(diào)控，B7-H4蛋白僅在正常組織中呈現(xiàn)微弱的表達(dá)。近來的研究表明，B7-H4分子在正常人新鮮分離的 T、B淋巴細(xì)胞、單

2、核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞（DCs）表面均無表達(dá)，但可以被體外活化刺激因子誘導(dǎo)表達(dá)，研究還發(fā)現(xiàn)，B7-H4分子在卵巢癌、乳腺癌、肺癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞以及腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞中異常高表達(dá)。這些證據(jù)都表明在腫瘤微環(huán)境中 B7-H4的表達(dá)對腫瘤細(xì)胞逃避機體的免疫監(jiān)視具有重要作用。目前，B7-H4分子的受體還未發(fā)現(xiàn)，但關(guān)于其受體的研究是目前免疫學(xué)研究的熱點之一，其受體的發(fā)現(xiàn)將會對幫助我們更進(jìn)一步的了解B7-H4分子的作用機制，為臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)

3、。
　　本研究旨在通過構(gòu)建 B7-H4-Fc融合蛋白的真核表達(dá)體系，獲得高純度的B7-H4-Fc融合蛋白，利用免疫沉淀法分離B7-H4受體，并利用熒光標(biāo)記的B7-H4-Fc融合蛋白檢測B7-H4受體在不同臨床標(biāo)本中的表達(dá)。
　　一、人B7-H4-Fc融合蛋白的表達(dá)及其應(yīng)用研究
　　【目的】體外克隆擴增人B7-H4分子的胞外段基因以及人Fc段基因，將其重組至pEGZ–Term真核表達(dá)載體，構(gòu)建表達(dá)人B7-H4-Fc融合蛋

4、白的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株并初步研究B7-H4-Fc融合蛋白的生物學(xué)功能。
　　【方法】通過PCR的方法體外擴增人B7-H4分子的胞外段基因和人Fc段基因，并分別克隆入T載體中，雙酶切后裝入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pEGZ–Term中，構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pEGZ–Term/B7-H4-Fc并進(jìn)行鑒定；與輔助病毒載體用脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293T制備含有重組病毒的培養(yǎng)上清，以其培養(yǎng)上清感染CHO細(xì)胞，經(jīng)Zeocin篩選出穩(wěn)定表達(dá)B7-H4-Fc融

5、合蛋白的CHO細(xì)胞株；通過流式細(xì)胞術(shù)和Western Blot檢測CHO/B7-H4-Fc轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株是否構(gòu)建成功，純化鑒定B7-H4-Fc融合蛋白并對其生物學(xué)功能進(jìn)行初步研究。
　　【結(jié)果】成功構(gòu)建了pEGZ–Term/B7-H4-Fc重組真核表達(dá)載體，篩選并鑒定獲得能穩(wěn)定高表達(dá)人B7-H4-Fc融合蛋白的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞并分離純化出了該融合蛋白，初步檢測該融合蛋白具有體外抑制T細(xì)胞增殖的作用，并利用該融合蛋白成功的分離純化出了B7-

6、H4受體。
　　【結(jié)論】成功的構(gòu)建了能穩(wěn)定表達(dá)B7-H4-Fc融合蛋白的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株，并分離純化出B7-H4-Fc融合蛋白，為進(jìn)一步研究B7-H4分子的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。利用免疫沉淀的方法，分離出了B7-H4受體分子。
　　二、檢測B7-H4未知受體的表達(dá)
　　【目的】利用熒光標(biāo)記的B7-H4-Fc融合蛋白，檢測B7-H4受體在多種細(xì)胞表面的表達(dá)。
　　【方法】以本研究獲得的B7-H4-Fc融合蛋白為基礎(chǔ)，對其

7、進(jìn)行異硫氰酸熒光素（FITC）熒光標(biāo)記，利用FITC標(biāo)記的B7-H4-Fc蛋白作為配體，流式細(xì)胞術(shù)檢測多種不同來源的淋巴細(xì)胞上B7-H4受體的表達(dá)。
　　【結(jié)果】檢測分析發(fā)現(xiàn)在來源于扁桃體的部分B淋巴細(xì)胞上組成性的表達(dá)B7-H4受體，在活化T細(xì)胞和肺癌組織、肺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)來源的T細(xì)胞也表達(dá)B7-H4受體。
　　【結(jié)論】檢測到組成性表達(dá)B7-H4受體的B淋巴細(xì)胞使我們提取B7-H4受體蛋白進(jìn)行進(jìn)一步的研究成為可能。B7-H4受