鼠抗人PD-L2單克隆抗體的制備及人可溶性PD-L2ELISA試劑盒的研制.pdf

1、協(xié)同刺激分子在免疫調(diào)節(jié)中起著重要的作用，PD-1(CD279)所介導(dǎo)的負(fù)性信號(hào)能導(dǎo)致T細(xì)胞的凋亡和功能衰竭，PD-L2(B7-DC，CD273)作為PD-1的第二配體，與PD-1作用抑制T細(xì)胞活化和IFN-γ的分泌。PD-L2為B7超家族成員，在蛋白結(jié)構(gòu)上包含有IgV樣區(qū)、IgC樣區(qū)、跨膜區(qū)和一個(gè)短而保守的胞漿區(qū)尾部。最近研究表明，PD-L2與血吸蟲(chóng)病、肺結(jié)核和過(guò)敏性哮喘的發(fā)病密切相關(guān)。PD-L2在同種異體反應(yīng)、自身免疫性疾病中也發(fā)揮重

2、要作用。研究表明，樹(shù)突狀細(xì)胞表面PD-L2與活化T細(xì)胞上PD-1相互作用后可顯著抑制效應(yīng)性T細(xì)胞的生物學(xué)功能和IL-2等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，PD-L2分子的缺失導(dǎo)致PD-1/PD-L2抑制途徑發(fā)生異常，進(jìn)而引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生自身免疫性疾病。
　　 許多協(xié)同刺激分子能分別以細(xì)胞膜型和可溶性?xún)煞N形式存在，包括OX40L、CD40L、B7-H3和PD-1等?？扇苄苑肿涌梢酝ㄟ^(guò)蛋白水解酶裂解細(xì)胞上的膜型分子而形成，也可以由免疫細(xì)胞直接分泌。許多可

3、溶性協(xié)同刺激分子具有臨床診斷價(jià)值，然而，可溶性PD-L2(sPD-L2)分子在機(jī)體中扮演何種角色，在疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮何種生物學(xué)作用，目前尚缺乏深入研究。
　　 本課題研究獲得了一株新型鼠抗人PD-L2功能性單克隆抗體，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行了初步研究；在此基礎(chǔ)上建立了特異性檢測(cè)人sPD-L2的ELISA方法，并對(duì)該ELISA檢測(cè)體系的穩(wěn)定性和精確性等進(jìn)行分析、評(píng)價(jià)：利用sPD-L2的ELISA方法對(duì)健康人和支氣管哮喘患者外周血

4、中的sPD-L2表達(dá)水平及特性進(jìn)行分析。
　　 一、鼠抗人PD-L2單克隆抗體的制備及生物學(xué)特性的研究
　　 目的：研制特異性識(shí)別人PD-L2(B7-DC)的鼠單克隆抗體，并對(duì)其生物學(xué)特性和PD-L2分子的表達(dá)特性進(jìn)行初步分析
　　 方法：以高表達(dá)人PD-L2分子的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞L929/PD-L2作為免疫原，常規(guī)免疫BAILB/c小鼠，采用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞融合，以L929/PD-L2作為抗體篩選細(xì)胞，

5、L929/mock為對(duì)照細(xì)胞，經(jīng)間接免疫熒光標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)分析、反復(fù)篩選和多次克隆化培養(yǎng)，篩選出分泌特異性鼠抗人PD-L2單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；采用Western blot、Ig亞型快速定性試紙法、間接免疫熒光法和競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抑制實(shí)驗(yàn)對(duì)單抗進(jìn)行生物學(xué)特性的分析，繼而利用該單抗進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PD-L2在腫瘤細(xì)胞株和免疫細(xì)胞上的表達(dá)特性。
　　 結(jié)果：通過(guò)多次融合和反復(fù)篩選，成功獲得一株特異性鼠抗人PD-L2的雜

6、交瘤，該雜交瘤分泌的單克隆抗體能特異識(shí)別人PD-L2分子。繼而利用上述研制獲得的單克隆抗體8F2進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記和流式細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，蛋白水平上PD-L2表達(dá)在THP-1、SHI-1、U937等單核來(lái)源的腫瘤細(xì)胞株，以及上調(diào)性表達(dá)在成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞上。
　　 結(jié)論：成功地獲得一株特異性鼠抗人PD-L2單克隆抗體，并對(duì)其生物學(xué)特性和表達(dá)譜進(jìn)行初步分析，證明其識(shí)別抗原表位不同于商品化抗體，是一株新型鼠抗人PD-L2單抗，

7、這為進(jìn)一步研究PD-1/PD-L2信號(hào)通路在免疫應(yīng)答中的生物學(xué)作用提供了有價(jià)值的物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 二、特異性檢測(cè)人可溶性PD-L2蛋白ELISA試劑盒的研制及哮喘患者外周血sPD-L2表達(dá)水平的檢測(cè)分析
　　 目的：研制特異性檢測(cè)人sPD-L2的ELISA試劑盒，為定量分析不同來(lái)源的臨床標(biāo)本和研究sPD-L2的功能提供有效的檢測(cè)手段。利用該ELISA試劑盒檢測(cè)健康人和哮喘患者外周血sPD-L2蛋白的表達(dá)，分析sPD-L2

8、在哮喘發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制。
　　 方法：利用anti-PD-L2 mAb(8F2)作包被抗體在碳酸鹽緩沖液中預(yù)包被ELISA板，biotin-anti-PD-L2 mAb(10D6)作為檢測(cè)抗體識(shí)別與8F2相結(jié)合的抗原，再與Streptavidin-HRP反應(yīng)，最后用TMB底物進(jìn)行顯色反應(yīng)，建立雙抗體夾心法檢測(cè)sPD-L2的酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒，并對(duì)該試劑盒的特異性進(jìn)行分析。利用上述建立的ELISA試劑盒檢測(cè)了80例健康人和11

9、0例哮喘患者外周血中sPD-L2的表達(dá)。
　　 結(jié)果：成功研制出檢測(cè)人sPD-L2的ELISA方法，該方法能特異性測(cè)定人sPD-L2蛋白，而與其他蛋白無(wú)交叉反應(yīng)。試劑盒檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線在抗原濃度為1.56-100ng/ml范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，并具有良好的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性和特異性。利用該sPD-L2 ELISA方法對(duì)哮喘患者及健康人的外周血中該因子的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析顯示，哮喘患者血清中sPD-L2的含量顯著升高。