人PD-L1基因轉(zhuǎn)染細胞株的構(gòu)建及其單克隆抗體的研制.pdf

1、PD-L1屬于共刺激分子B7家族成員，含有290個氨基酸，是I型跨膜蛋白。PD-L1廣泛表達于T細胞、B細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞及一些非造血細胞。PD-L1與其受體PD-1結(jié)合后傳遞抑制信號，在T細胞的活化、耐受和免疫介導的組織損傷中發(fā)揮負性免疫調(diào)節(jié)作用，參與機體免疫穩(wěn)態(tài)的維持。PD-1/PD-L1途徑與自身免疫性疾病、移植排斥反應、慢性病毒感染及腫瘤免疫等疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。PD-L1分子在多種腫瘤組織中表達，與腫瘤細胞的分化

2、程度、TNM分期及不良預后密切相關(guān)，可作為多種腫瘤診斷和預后標志物及診斷和治療的靶點。
　　本文構(gòu)建了穩(wěn)定表達人PD-L1分子的基因轉(zhuǎn)染細胞株L929/PD-L1，觀察了PD-1/PD-L1途徑對活化Jurkat細胞增殖與凋亡的影響，證實PD-L1的負性免疫調(diào)控作用；以L929/PD-L1為免疫原，采用B淋巴細胞雜交瘤技術(shù)，建立了穩(wěn)定分泌特異性鼠抗人PD-L1單克隆抗體的雜交瘤細胞株，并初步研究單抗的生物學特性。
　　一、人

3、PD-L1基因轉(zhuǎn)染細胞株的構(gòu)建及其對活化Jurkat細胞增殖和凋亡的影響
　　【目的】構(gòu)建穩(wěn)定表達人PD-L1分子的基因轉(zhuǎn)染細胞株，并鑒定其生物學活性。
　　【方法】將編碼人PD-L1分子的全長 cDNA重組入逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體pEGZ-Term-R，采用脂質(zhì)體法將重組載體pEGZ-Term-R/PD-L1和輔助的病毒載體共轉(zhuǎn)染293T細胞，包裝具有感染能力的完整病毒，收集含有完整重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的細胞培養(yǎng)上清，感染L929細

4、胞，篩選并獲得G418抗性的基因轉(zhuǎn)染細胞。采用流式細胞術(shù)篩選并獲得表達PD-L1的基因轉(zhuǎn)染細胞，命名為L929/PD-L1。采用PHA活化T細胞系來源的細胞株 Jurkat，并將其與絲裂霉素預處理的L929/PD-L1細胞共培養(yǎng)，用細胞計數(shù)法觀察L929/PD-L1細胞株對活化Jurkat細胞增殖能力的影響，并檢測其凋亡情況。
　　【結(jié)果】成功獲得了穩(wěn)定表達人PD-L1的基因轉(zhuǎn)染細胞株L929/PD-L1。PHA可誘導Jurkat

5、細胞活化并表達PD-1分子；L929/PD-L1與PHA刺激后Jurkat細胞共培養(yǎng)，可抑制Jurkat細胞增殖，促進其凋亡。
　　【結(jié)論】成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達人PD-L1分子的基因轉(zhuǎn)染細胞株，PD-L1分子對活化Jurkat細胞增殖的抑制和凋亡的促進，進一步證實了PD-1/PD-L1途徑的負性免疫調(diào)控作用，也為進一步探討PD-L1的生物學作用奠定了基礎。
　　二、鼠抗人PD-L1單克隆抗體的研制
　　【目的】研制鼠抗人

6、PD-L1單克隆抗體，為探討PD-1/PD-L1途徑在免疫病理機制中的作用奠定物質(zhì)基礎。
　　【方法】以L929/PD-L1為免疫原免疫6-8周齡的BALB/c雌鼠，將骨髓瘤細胞P3X63Ag8與免疫小鼠的脾臟細胞融合，采用HAT和HT選擇性培養(yǎng)基篩選雜交瘤。以L929/PD-L1細胞株為陽性篩選抗原，采用流式細胞術(shù)鑒定、有限稀釋法亞克隆、western blot鑒定等篩選分泌特異性鼠抗人PD-L1單抗的雜交瘤細胞株；利用小鼠免疫

7、球蛋白亞類快速定性試紙鑒定單抗亞型；以L929/PD-L1細胞為抗原，采用競爭抑制試驗結(jié)合流式細胞術(shù)分析單抗的識別位點；進而比較所獲單抗與商品化單抗MIH1對腫瘤細胞株表達的PD-L1分子的識別。
　　【結(jié)果】成功獲得l株能夠持續(xù)穩(wěn)定分泌鼠抗人PD-L1單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為6G4；經(jīng)小鼠免疫球蛋白亞類快速定性試紙分析鑒定，6G4的重鏈為IgM，輕鏈為κ鏈；競爭實驗顯示，單抗6G4與商品化抗人PD-L1單抗MIH1識別的