雞PD-1及其配體PD-L1胞外區(qū)基因的克隆表達(dá)及多克隆抗體的制備.pdf

1、PD-1（Programmed cell death1）是免疫球蛋白超家族成員之一，最早在T細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)研究中發(fā)現(xiàn)，Ahmed及其同事在LCMV慢性感染小鼠模型中證實(shí)PD-1是T細(xì)胞表面的一種抑制性受體。PD-1與PD-Ls介導(dǎo)的信號(hào)通路對T細(xì)胞的免疫抑制性信號(hào)的激活，T細(xì)胞的增殖及平衡免疫過程介導(dǎo)的組織損傷起到重要地調(diào)節(jié)作用。PD-1的配體有兩種類型，分別為PD-L1和PD-L2。阻斷PD-1與其配體的結(jié)合可以使病毒持續(xù)性感

2、染時(shí)功能障礙或衰竭的CD8+T細(xì)胞功能恢復(fù)。由于PD-1:PD-L1通路在中樞免疫和外周免疫反應(yīng)中傳遞免疫耐受和免疫抑制信號(hào)，使得PD-1及其配體PD-L1成為近年來人們在慢性持續(xù)性病毒感染、免疫耐受性疾病、腫瘤等免疫抑制性疾病研究中關(guān)注的熱點(diǎn)。目前，雖然已經(jīng)證實(shí)雞T細(xì)胞表面存在PD-1分子，但對于PD-1及PD-L1分子在雞等禽類動(dòng)物病毒感染導(dǎo)致的免疫抑制性疾病或病毒持續(xù)性感染疾病中發(fā)揮的生物學(xué)功能和作用的相關(guān)研究才剛剛起步。本研究以

3、雞PD-1及其配體PD-L1的胞外區(qū)為研究對象，通過克隆、表達(dá)及純化等技術(shù)，最終獲得具有活性的雞PD-1及PD-L1胞外區(qū)原核表達(dá)重組蛋白，以期進(jìn)一步應(yīng)用該基因表達(dá)產(chǎn)物制備特異性的單克隆抗體，為探索 PD-1和 PD-L1在禽類相關(guān)免疫抑制性疾病過程中發(fā)揮的生物學(xué)功能奠定研究基礎(chǔ)。
　　本研究根據(jù)GenBank中雞PD-1和PD-L1的基因序列，通過生物信息學(xué)比對分析及原核表達(dá)載體多克隆酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)其胞外區(qū)引物，以雞外周血單個(gè)核

4、細(xì)胞（PBMC）的cDNA為模板，應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增雞PD-1和PD-L1胞外區(qū)片段。構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒 pET-28a-PD-1和 pET-32a-PD-L1，經(jīng)雙酶切和測序正確后轉(zhuǎn)化至宿主菌 Rosetta（DE3）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。應(yīng)用SDS-PAGE和Western-blot方法分析重組蛋白的表達(dá)情況及表達(dá)形式，鑒定重組蛋白的抗原特異性。然后采用切膠回收和His鎳柱親和層析獲得兩種重組蛋白的純化產(chǎn)物，并制備兔抗高免血清。分別利用E

5、LISA和Western-blot方法來鑒定多抗血清的效價(jià)和免疫學(xué)活性。
　　研究結(jié)果表明，成功擴(kuò)增出雞PD-1和PD-L1胞外區(qū)目的基因，并克隆至表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)和pET-32a(+)。經(jīng)PCR、雙酶切和測序結(jié)果比對分析未發(fā)生氨基酸突變現(xiàn)象，成功構(gòu)建了原核重組表達(dá)載體 pET-28a-PD-1和 pET-32a-PD-L1。重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Rosetta宿主菌后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE分析顯示，表達(dá)出與預(yù)期大

6、小相一致的目的蛋白條帶，其分子量分別為20kDa和44kDa，且兩種重組蛋白均以包涵體形式存在。Western-blot鑒定結(jié)果顯示，PD-1和PD-L1的胞外區(qū)重組蛋白分別能被His標(biāo)簽單抗所識(shí)別，二者均具有良好的反應(yīng)原性。PD-1和PD-L1重組蛋白經(jīng)純化后，分別得到濃度為0.8mg/mL和1.5mg/mL重組目的蛋白。通過間接ELISA和Western-blot方法分析PD-1和PD-L1兔多抗血清的效價(jià)和免疫學(xué)活性，結(jié)果表明，P