豬免疫抑制性受體PD-1及其配體PD-L1胞外區(qū)原核表達(dá)及其活性的初步分析.pdf

1、PD-1最初是從T細(xì)胞中克隆出來的，是CD28家族的一個(gè)成員，主要在活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞和單核細(xì)胞上表達(dá)，有PD-L1和PD-L2兩個(gè)配體。PD-1及其配體相互作用致使效性 T細(xì)胞的功能抑制，在阻斷 PD-1/PD-L1通路后，可使功能耗竭的T細(xì)胞功能恢復(fù)。有研究表明，PD-1的表達(dá)量與疾病的進(jìn)程有關(guān)，且在阻斷PD-1/PD-L1通路后可治療持續(xù)性病毒感染。但是，由于缺乏原材料，在豬病中對(duì)PD-1/PD-L1通路的研究較少。本研究以豬P

2、D-1及PD-L1為研究對(duì)象，通過克隆、原核表達(dá)獲得正確表達(dá)的PD-1及PD-L1胞外區(qū)蛋白，為研究PD-1/PD-L1通路在豬病的作用提供原材料。
　　本研究根據(jù)GenBank中豬PD-1和PD-L1的基因序列及原核表達(dá)載體多克隆酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)其胞外區(qū)引物，以豬外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）的cDNA為模板，應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增PD-1、PD-L1胞外區(qū)片段，并與pMD18-T-simple載體連接，構(gòu)建pMD-PD1、pMD-PD

3、L1重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至DH5α中通過菌液PCR篩選陽性克隆并測(cè)序，利用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ分別對(duì)陽性重組質(zhì)粒pMD-PD1、pMD-PDL1及原核表達(dá)載體pET-32a(+)進(jìn)行雙酶切并回收，利用T4 DNA連接酶連接回收的酶切目的片段及載體片段，構(gòu)建pET-32a-PD1和pET-32a-PDL1原核表達(dá)載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α中，經(jīng)鑒定正確后轉(zhuǎn)化至宿主菌Rosetta（DE3）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。應(yīng)用SDS-PAGE分析重組

4、蛋白的表達(dá)情況，Western-blot鑒定重組蛋白的抗原特異性。然后采用鎳柱對(duì)重組目的蛋白進(jìn)行分離純化，并制備多抗血清。以兩種胞外區(qū)重組蛋白免疫后獲得的具有免疫學(xué)活性的多抗血清為一抗，檢測(cè)豬PBMC細(xì)胞表面PD-1及PD-L1對(duì)兩種多抗血清的結(jié)合效果，以驗(yàn)證所獲PD-1及PD-L1胞外區(qū)重組蛋白是具有生物學(xué)活性。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，成功擴(kuò)增出366bp的PD-1和684bp的PD-L1胞外區(qū)基因，測(cè)序結(jié)果表明，所獲得的兩個(gè)目的片

5、段均未發(fā)生氨基酸的突變。成功構(gòu)建的pET-32a-PD1和pET-32a-PDL1原核重組表達(dá)載體并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，分別獲得了33kDa和45kDa的兩條目的蛋白條帶，且兩種重組蛋白均以包涵體形式存在。Western-blot鑒定結(jié)果顯示，PD-1及PD-L1胞外區(qū)重組目的蛋白均能與載體特異性標(biāo)簽His單抗反應(yīng)，同時(shí)PD-1還可以與抗人PD-1單抗反應(yīng)，表明兩種胞外區(qū)蛋白均成功誘導(dǎo)表達(dá)。PD-1和 PD-L1

6、胞外區(qū)重組蛋白經(jīng)鎳柱純化后，濃度分別為0.9mg/mL和1.5mg/mL。免疫家兔制備兔抗豬PD-1及PD-L1多抗血清，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)獲得的多抗與PBMC上PD-1和PD-L1的反應(yīng)性，結(jié)果顯示獲得的多抗能與PBMC上的PD-1和 PD-L1蛋白發(fā)生反應(yīng)。通過以上結(jié)果初步證明，本研究通過原核表達(dá)并純化獲得的PD-1及PD-L1胞外區(qū)重組蛋白，具有生物學(xué)活性，可用于制備其相應(yīng)的單克隆抗體或者作為可溶性分子用于阻斷PD-1/PD-L1