PD-L1免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用與延長移植物存活及其機(jī)制.pdf

1、目的：
　　 I型糖尿病是一種主要由T細(xì)胞介導(dǎo)的，CD4+、CD8+T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤胰島導(dǎo)致分泌胰島素的β細(xì)胞受損，使胰島素分泌減少，導(dǎo)致胰島素絕對缺乏。目前已證實(shí)該疾病和自身免疫耐受缺失有關(guān)，自身反應(yīng)性T細(xì)胞在I型糖尿病的免疫發(fā)病機(jī)理中起主導(dǎo)作用。PD-L1 已被證實(shí)為免疫負(fù)性調(diào)節(jié)受體PD-1的配體，文獻(xiàn)證明PD-L1在免疫負(fù)性調(diào)節(jié)及外周耐受中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建PD-L1表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染NIT細(xì)胞，通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探討P

2、D-L1免疫調(diào)節(jié)作用，研究其在鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型中延長胰島移植存活時間及其作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.穩(wěn)定表達(dá)pPD-L1的NIT-1細(xì)胞株的建立用LipofectamineTM2000 將pPD-L1-EGFP n1和pEGFPn1兩個質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染NIT-1細(xì)胞系獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，分別命名為NIT-PD-L1和NIT-EGFP。
　　 2.致敏淋巴細(xì)胞的制備分別用三組刺激細(xì)胞NI

3、T-1、NIT-PD-L1和NIT-EGFP體內(nèi)腹腔注射Balb/c小鼠，間隔1 周再腹腔注射一次，細(xì)胞免疫后第14天分離Balb/c小鼠脾臟單個核細(xì)胞作為致敏淋巴細(xì)胞備用。
　　 3.混合細(xì)胞培養(yǎng)將經(jīng)過絲裂霉素C處理的NIT-1、NIT-PD-L1和NIT-EGFP三組細(xì)胞作為刺激細(xì)胞分別與新鮮分離的脾臟淋巴細(xì)胞和（或）上述致敏淋巴細(xì)胞進(jìn)行混合培養(yǎng)7天。
　　 4.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)用CFSE預(yù)染上述小鼠淋巴細(xì)胞，待細(xì)胞混合

4、培養(yǎng)7天后，F(xiàn)CM檢測淋巴細(xì)胞的增殖。
　　 5.細(xì)胞凋亡檢測收集上述細(xì)胞混合培養(yǎng)7天后的淋巴細(xì)胞，Annexin V-cy5和PI染色，F(xiàn)CM檢測淋巴細(xì)胞的凋亡。
　　 6.細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)分別用三組刺激細(xì)胞NIT-1、NIT-PD-L1和NIT-EGFP 體內(nèi)腹腔注射Balb/c小鼠，間隔1 周再腹腔注射一次，細(xì)胞免疫后第14天分離小鼠脾淋巴細(xì)胞，將刺激細(xì)胞與上述獲得的脾淋巴細(xì)胞以1：10的比例混合培養(yǎng)，3天后收集淋巴細(xì)胞

5、作為效應(yīng)細(xì)胞。將NIT-1細(xì)胞用CFSE 染色，作為靶細(xì)胞，并以1：20的比例與效應(yīng)細(xì)胞混合培養(yǎng)，4 小時后用PI 染色，F(xiàn)CM檢測壞死細(xì)胞數(shù)。
　　 7.細(xì)胞因子檢測收集上述混合細(xì)胞培養(yǎng)上清，ELISA檢測細(xì)胞因子的分泌水平；收集上述混合培養(yǎng)后的淋巴細(xì)胞，F(xiàn)CM檢測淋巴細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)。
　　 8.PD-L1誘導(dǎo)同種胰島移植耐受實(shí)驗(yàn)
　　 (1)STZ誘導(dǎo)糖尿病模型用小劑量多次腹腔注射STZ的方法誘導(dǎo)糖尿病

6、模型。
　　 (2)細(xì)胞腹腔移植將NIT-1、NIT-EGFP 或NIT-PD-L1細(xì)胞（1.5×107）注射到Balb/c 糖尿病模型小鼠腹腔。
　　 (3)血糖、體重、胰島素釋放實(shí)驗(yàn)以及生存時間觀察移植后每隔一天監(jiān)測一次血糖、體重及生存時間；在移植后第7天和24天，用放免法檢測葡萄糖刺激的胰島素釋放量實(shí)驗(yàn)。
　　 (4)細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、培養(yǎng)上清細(xì)胞因子及胞內(nèi)細(xì)胞因子的測定方法同上。
　　 (5)小

7、鼠血清細(xì)胞因子測定移植后第7天，收集小鼠血清，ELISA檢測細(xì)胞因子的表達(dá)。
　　 (6)腹腔淋巴細(xì)胞凋亡以及腹腔沖洗細(xì)胞免疫熒光染色移植后第7天，收集小鼠腹腔沖洗細(xì)胞，F(xiàn)CM檢測腹腔淋巴細(xì)胞凋亡；免疫熒光染色檢測移植細(xì)胞的排斥情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.PD-L1對同種淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用
　　 (1)PD-L1對同種淋巴細(xì)胞的增殖與凋亡的影響：新鮮分離的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞，與未修飾的NIT

8、-1 或PD-L1 修飾的NIT-1（NIT-PD-L1）作為刺激細(xì)胞混合培養(yǎng)，F(xiàn)CM檢測結(jié)果表明未修飾的NIT-1 刺激的淋巴細(xì)胞增殖率顯著高于NIT-PD-L1 刺激的增殖率；
　　 未修飾的NIT-1 致敏淋巴細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞，與未修飾的NIT-1 或NIT-PD-L1作為刺激細(xì)胞混合培養(yǎng)，F(xiàn)CM檢測結(jié)果表明未修飾的NIT-1 刺激的淋巴細(xì)胞增殖率顯著高于NIT-PD-L1 刺激的增殖率，而NIT-1誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞凋亡率低

9、于NIT-PDL1誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞凋亡率；
　　 NIT-PD-L1 致敏的淋巴細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞，與未修飾的NIT-1 或NIT-PD-L1作為刺激細(xì)胞混合培養(yǎng)，NIT-PD-L1 刺激的淋巴細(xì)胞增殖率顯著低于未修飾的NIT 刺激的淋巴細(xì)胞增殖，且可誘導(dǎo)反應(yīng)細(xì)胞凋亡。結(jié)果表明PD-L1可抑制新鮮分離的初次反應(yīng)性淋巴細(xì)胞和致敏淋巴細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)其凋亡。
　　 (2)PD-L1對細(xì)胞因子的表達(dá)與分泌的影響：FCM檢測淋巴細(xì)

10、胞內(nèi)細(xì)胞因子以及ELISA檢測分泌性細(xì)胞因子結(jié)果表明，與NIT-1 或NIT-EGFP誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞相比，NIT-PD-L1細(xì)胞誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞表達(dá)與分泌IL-4、IL-10 水平顯著增高，而IFN-γ水平明顯降低。
　　 (3)PD-L1對CTL活性的影響：通過NIT-1、NIT-PD-L1 或NIT-EGFP 三組細(xì)胞分別體內(nèi)外聯(lián)合刺激獲得的脾淋巴細(xì)胞，分別與NIT-1細(xì)胞體外共培養(yǎng)后，CFSE與PI 雙染色，F(xiàn)CM檢測結(jié)果表

11、明，NIT-1 或NIT-EGFP細(xì)胞誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞介導(dǎo)NIT-1 靶細(xì)胞中度壞死，而NIT-PD-L1細(xì)胞誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞介導(dǎo)NIT-1 靶細(xì)胞輕度壞死，結(jié)果表明PD-L1可體內(nèi)外抑制CTL的激活與效應(yīng)。
　　 2.PD-L1 延長STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠胰島移植物的存活
　　 將NIT-1、NIT-PD-L1和NIT-EGFP 三組細(xì)胞分別移植入STZ誘導(dǎo)的Balb/c 糖尿病小鼠腹腔，觀察移植前后的血糖、體重、糖刺

12、激的胰島素釋放及生存時間，以及脾臟細(xì)胞的增殖與凋亡、細(xì)胞因子的表達(dá)與分泌，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：
　　 (1)PD-L1對糖尿病小鼠體重、血糖及存活時間的影響：移植NIT-1、NIT-PDL1或NIT-EGFP細(xì)胞后第3天，各組糖尿病小鼠血糖均降至正常范圍，其中移植NIT-1 或NIT-EGFP細(xì)胞的對照組糖尿病小鼠血糖，在第7天左右升高并超過正常血糖水平；而移植NIT-PD-L1細(xì)胞的糖尿病小鼠可維持正常血糖水平約21天，隨后逐漸升高

13、，于移植后第24天血糖升高且超過正常上限(>11.1mmol/L)；
　　 在移植后第7天，移植NIT-1或NIT-EGFP細(xì)胞的對照組糖尿病小鼠體重逐漸下降，而移植NIT-PD-L1的糖尿病小鼠體重逐漸增加；移植NIT-PD-L1細(xì)胞糖尿病小鼠的生存時間比移植NIT-1或NIT-EGFP細(xì)胞的糖尿病小鼠明顯延長。
　　 (2)葡萄糖刺激的胰島素釋放：進(jìn)一步檢測葡萄糖刺激的胰島素釋放，由于移植NIT-1或NIT-EGFP

14、細(xì)胞的糖尿病小鼠在移植后24天內(nèi)均死亡，所以24天組僅包括移植NIT-PD-L1細(xì)胞的小鼠。檢測結(jié)果表明，在移植后第7天，移植NIT-1或NIT-EGFP細(xì)胞的小鼠胰島素釋放量明顯低于正常小鼠，而移植NIT-PD-L1細(xì)胞的小鼠胰島素釋放量與正常小鼠對照組相比無顯著性差異，表明NIT-PD-L1細(xì)胞維持正常功能；但在移植后24天，移植NIT-PD-L1細(xì)胞小鼠的胰島素釋放量低于正常對照組小鼠，提示可能發(fā)生排斥反應(yīng)。
　　 (3)

15、PD-L1 延長移植物存活的免疫學(xué)機(jī)制：為了研究PD-L1 延長移植物存活的機(jī)制，在細(xì)胞移植后第7天，分別檢測了脾淋巴細(xì)胞和腹腔淋巴細(xì)胞的增殖與凋亡。FCM檢測結(jié)果表明，移植NIT-1 或NIT-EGFP細(xì)胞的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)顯著高于NIT-PD-L1細(xì)胞移植小鼠，而細(xì)胞凋亡率低于NIT-PD-L1細(xì)胞移植的小鼠；
　　 在移植后第7天，F(xiàn)CM檢測脾淋巴細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子以及ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清和血清細(xì)胞因子結(jié)果表明，移

16、植NIT-1 或NIT-EGFP細(xì)胞的小鼠脾淋巴細(xì)胞內(nèi)IFN-γ表達(dá)明顯高于NIT-PD-L1細(xì)胞移植小鼠，而IL-4和IL-10 顯著低于移植NIT-PD-L1細(xì)胞的小鼠；脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清與小鼠血清中細(xì)胞因子檢測結(jié)果與胞內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)類似。上述結(jié)果表明PD-L1 抑制淋巴細(xì)胞增殖同時促進(jìn)其凋亡；胞內(nèi)細(xì)胞因子和ELISA檢測結(jié)果顯示，PD-L1 抑制IFN-γ的表達(dá)，而增加IL-4和IL-10的產(chǎn)生，從而促進(jìn)Th1細(xì)胞向Th2細(xì)胞漂

17、移。
　　 (4)腹腔沖洗細(xì)胞活性：腹腔沖洗細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果顯示，移植NIT-PD-L1細(xì)胞的小鼠腹腔中胰島素陽性細(xì)胞數(shù)量明顯高于移植NIT-1 或NIT-EGFP細(xì)胞的小鼠，而移植NIT-PD-L1細(xì)胞小鼠腹腔中淋巴細(xì)胞凋亡數(shù)增高，且浸潤程度顯著低于移植NIT-1 或NIT-EGFP細(xì)胞的小鼠組。
　　 結(jié)論：PD-L1基因修飾的NIT可明顯抑制同種淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)，同時誘導(dǎo)其凋亡；PD-L1可抑制CTL的活性，