負性共刺激分子PD-L1在卵巢癌免疫逃逸中的作用及其機制.pdf

1、卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)生機制及病因學尚未明確。近年來，隨著腫瘤微環(huán)境在癌癥發(fā)生和發(fā)展認識的加深，人們對于卵巢癌免疫逃逸機制的探討成為該領域前沿課題。作為腫瘤免疫效應階段的執(zhí)行場所，腫瘤微環(huán)境內(nèi)存在許多因素參與腫瘤組織與免疫系統(tǒng)的相互作用，包括局部效應細胞功能障礙、抑制性免疫細胞和細胞因子的負調(diào)節(jié)作用、抑制性配體受體反應以及腫瘤微環(huán)境中T細胞代謝活性的負調(diào)節(jié)等。
　　研究顯示，作為重要的一組參與免疫逃逸的B7家

2、族負性共刺激分子在癌組織中表達是腫瘤微環(huán)境中極為重要的一個特征，其中，PD-L1是近年來備受關注的負性免疫分子，稱之為免疫卡控點（Immune Checkpoint），其通過抑制T細胞的增殖、細胞因子的分泌和促進T細胞的凋亡負性調(diào)控T細胞的免疫應答，在腫瘤免疫逃逸過程發(fā)揮著極為重要的作用。
　　本文以免疫卡控點分子PD-L1為靶分子，以腫瘤微環(huán)境為切入點，借助組織學、細胞生物學、免疫學、動物學手段，探討該分子介導卵巢癌的免疫逃逸的

3、作用及機制。
　　論文第一部分采用免疫組織化學方法檢測了人卵巢癌組織中 PD-L1分子的表達（n=81），分析其和浸潤腫瘤相關巨噬細胞（TAM）、CD8+T細胞、細胞增殖抗原 Ki-67的相關性。結果顯示：①卵巢癌組織 PD-L1分子的表達可分為胞膜為主型（9/81，11.11％），胞漿為主型（32/81，39.50％），胞膜胞漿混合型（13/81，16.05％），胞膜胞漿低/不表達型（27/81，33.33％）；②癌細胞不同部位

4、 PD-L1表達水平與FIGO分期和病理類型均無關（P>0.05），但低分化組癌細胞膜上PD-L1分子的表達高于中低分化組（P<0.05）；③在癌細胞胞漿PD-L1低/不表達組和中/高表達組CD8+T淋巴細胞浸潤程度有差異（P<0.05），在癌細胞胞膜低/不表達組和中/高表達組中CD68+細胞浸潤程度有差異（P<0.05）。
　　論文第二部分探討了PD-L1分子在卵巢癌細胞上的表達及其意義。首先通過小分子干擾RNA（siRNA）干

5、擾卵巢癌細胞株中PD-L1分子的表達來觀察該分子在腫瘤增殖、侵襲中所發(fā)揮的作用，并進一步驗證卵巢癌細胞 PD-L1分子介導的T細胞凋亡作用，進而在卵巢癌模型中評價干預 PD-L1信號的免疫治療價值。結果顯示：①干擾卵巢癌細胞中 PD-L1分子后腫瘤細胞的增殖受到抑制，侵襲能力明顯下降；②在腫瘤相關巨噬細胞誘導下卵巢癌細胞膜上上調(diào)表達的PD-L1分子能促進CD8+T細胞的凋亡，采用PD-L1單抗能阻斷上述效應；③建立小鼠卵巢癌ID8模型，

6、成瘤小鼠腫瘤組織和脾臟中CD8+T細胞均存在P D-1分子的表達，分別采用阻斷型PD-L1單抗和阻斷型PD-1單抗進行免疫治療，和對照組相比，抗體治療組均能明顯控制腫瘤生長，且伴有脾臟中C D8+T細胞上P D-1分子的表達下調(diào)。
　　論文第三部分探討卵巢癌細胞上 PD-L1分子的表達及其可能的調(diào)節(jié)機制。結果顯示：①體外培養(yǎng)的SKOV3細胞中存在PD-L1分子mRNA的表達，但其蛋白質(zhì)水平的表達不位于膜表面，而是在胞內(nèi)，體內(nèi)成瘤過

7、程能上調(diào) SKOV3細胞膜PD-L1分子的表達；②胞內(nèi)細胞因子染色檢測結果表明，卵巢癌組織來源的腫瘤相關巨噬細胞（TAM）可分泌IL-6、IL-10、TNF-?、IFN-?。免疫組化結果亦證實癌組織中IL-6、IL-10、TNF-?、IFN-?的表達水平均高于卵巢良性疾病組織；③進而觀察了TAM及相關細胞因子對卵巢癌細胞表面P D-L1的調(diào)節(jié)作用。結果顯示，采用TAM上清及相關因子IL-6、IL-10、TNF-?、IFN-?培養(yǎng)SKOV

8、3細胞96 h后，SKOV3細胞膜表面PD-L1分子的表達明顯上調(diào)。Western blot和real-time PCR分析顯示，不同細胞因子刺激下 SKOV3細胞 PD-L1分子表達的增加在于總蛋白表達水平增加，而并非在于轉錄水平的改變；④Western blot分析顯示，TNF-α、IFN-γ刺激SKOV3細胞15 min后ERK1/2的磷酸化、AKT的磷酸化明顯增加，不伴有STAT3磷酸化的增加；IL-6、IL-10刺激SKOV3

9、細胞不能促進ERK1/2的磷酸化和AKT的磷酸化，但IL-6可上調(diào)STAT3的磷酸化。⑤采用化學阻滯劑封閉AKT信號后，IFN-γ介導SKOV3細胞膜表面表達PD-L1分子效應部分阻斷。采用化學阻滯劑封閉ERK信號后，TNF-α介導SKOV3細胞膜表面表達PD-L1分子效應部分阻斷；封閉AKT信號和ERK信號不影響IL-10、IL-6上調(diào)SKOV3細胞膜上PD-L1分子表達的效應；STAT3抑制劑 AG490也不影響 IL-6、IL-1

10、0上調(diào)SKOV3細胞膜上PD-L1分子表達的作用。
　　論文第四部分將在卵巢癌中分析一群以表達 PD-L1分子為特征的腫瘤相關巨噬細胞，探討其生物學特征和臨床檢測意義。研究結果發(fā)現(xiàn)：①卵巢癌組織浸潤巨噬細胞較卵巢囊腫浸潤巨噬細胞更高水平表達 PD-L1分子。在卵巢癌患者外周血，存在一群以表達PD-L1分子為特征的巨噬細胞，III-IV期卵巢癌患者外周血中這群細胞的含量高于I-II期患者（P<0.05）；②進一步的分析顯示，和PD-

11、L1分子表達陰性的巨噬細胞相比，P D-L1分子表達陽性的巨噬細胞的細胞因子分泌有不同的特點，提示這可能構成一群獨立的巨噬細胞亞群，在卵巢癌發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用的細胞亞群。
　　綜上，卵巢癌以不同程度和方式表達PD-L1分子，胞膜上出現(xiàn)PD-L1分子的表達也伴隨著癌細胞惡性程度的增加，PD-L1分子的表達也和浸潤腫瘤相關巨噬細胞、CD8+T細胞、核增殖抗原存在相關；腫瘤微環(huán)境能介導卵巢癌細胞膜上PD-L1分子表達的上調(diào)，而不影響

12、胞漿中PD-L1分子的表達，也不影響其mRNA水平，其中，腫瘤相關巨噬細胞來源的多種細胞因子發(fā)揮重要作用，涉及到了AK T、ERK1/2信號；卵巢癌細胞胞漿中PD-L1分子的表達具有功能性，可維系腫瘤細胞的增殖和侵襲，膜表面PD-L1分子的表達則發(fā)揮抑T細胞活性的作用；采用PD-L1、PD-1單抗均可在卵巢癌荷瘤模型中發(fā)揮抗腫瘤作用。此外，PD-L1分子還可通過腫瘤相關細胞進一步介導免疫逃逸，以表達 PD-L1分子為特征的腫瘤相關巨噬細