miRNA-200家族在上皮性卵巢癌中的表達及其分子作用機制的研究.pdf

1、上皮性卵巢癌(EOC)是最常見的婦科惡性腫瘤之一，全球每年有>23000例新發(fā)及>14000例死亡病例。臨床上大多數(shù)EOC患者在就診時都已處于腫瘤晚期，晚期上皮性卵巢癌的5年生存率低于30％。目前對導致這一惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的分子作用機理仍知之甚少，臨床上對EOC的早期篩查和早期診斷的難度較大。因此尋找可以在高危人群中篩選、協(xié)助早期診斷EOC的患者腫瘤分子標志物及其相關分子機制一直是國內(nèi)外腫瘤學者研究的熱點。近年來，隨著基因技術的快速

2、發(fā)展，腫瘤分子標志物的研究方向已經(jīng)從CA125、CA199等蛋白質(zhì)層面深入到了更本質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄層面。微小RNA(miRNA)是一類長約19～25個核苷酸的小分子非編碼RNA，通過與其靶mRNA分子的3’端非編碼區(qū)域(3'UTR)互補配對使目標mRNA分子受到翻譯水平調(diào)控或直接導致其降解，參與調(diào)控細胞生長分化、能量代謝、凋亡等各個重要而基本的細胞生理過程。miRNA調(diào)節(jié)基因表達作用的改變與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的聯(lián)系，因此其作為新的腫瘤

3、分子標志物具有較好的應用前景。miRNA-200家族在EOC中的表達較其它miRNA高，且與正常卵巢組織中的表達相比在EOC中明顯過度表達。細胞的表型改變，即上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變（EMT）是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要步驟。miRNA-200家族還參與調(diào)節(jié)其預測靶基因之一—上皮鈣粘蛋白轉(zhuǎn)錄抑制因子ZEB及其信號網(wǎng)絡系統(tǒng)ZEB1/deltaEF1、ZEB2/SIP1，從而通過調(diào)節(jié)細胞的EMT與MET（間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)變）的平衡，最終影響EOC的發(fā)生、發(fā)

4、展。
　　目前檢測miRNA表達最靈敏、可靠的方法是實時定量熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（qPCR)，但常規(guī)的qPCR無法擴增只有19～25個核苷酸組成的miRNA分子，需要特殊的設計或?qū)悠诽貏e處理，常用的處理方法主要包括莖環(huán)法和PAP法。2005年，Chen等設計出一種莖環(huán)結(jié)構的引物，以此代替常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄反應中的隨機引物或oligo(dT)引物，對逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用TaqMan探針實時定量PCR法進行檢測，簡稱莖環(huán)法；同年，Shi等利用大腸

5、桿菌poly(A)聚合酶將RNA加上poly(A)尾，用含oligo(dT)的引物進行逆轉(zhuǎn)錄反應，對產(chǎn)物用熒光染料SYBR Green I實時定量PCR法檢測，簡稱PAP法。莖環(huán)法的特異性和靈敏度比PAP法高，但引物設計難度大，檢測通量低；PAP法引物設計難度較低，檢測通量較高，但特異性和靈敏度較差。PAP法實時定量PCR適于大規(guī)模miRNA篩選實驗，而本研究采用的莖環(huán)法實時定量PCR則適于有針對性地檢測小規(guī)模miRNA。
　　除

6、ZEB以外，轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β2、胰島素樣生長因子受體IGF-1R也是Target Scan軟件對miRNA-200家族的常見的預測靶基因，TGF-β2及IGF-1R在EOC中高表達，TGF-β2信號通路及IGF-1R信號通路也參與調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機制之一—EMT，但國內(nèi)外也尚未有研究證實TGF-β2、IGF-1R是miRNA-200家族的靶基因，TGF-β2、IGF-1R與miRNA-200家族在EOC發(fā)生、發(fā)展的相關分子機

7、制仍需深入研究。
　　目的：在基因水平及蛋白水平檢測miRNA-200家族中的miRNA-200a、miRNA-200c及其預測靶基因TGF-β2、IGF-1R在上皮性卵巢癌組織中的表達，探討它們的相關性及其與臨床病理特征間的關系，為探索miRNA-200家族及其預測靶基因在上皮性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展機制研究提供新的理論依據(jù)，為發(fā)掘 miRNA-200家族作為新一代的上皮性卵巢癌早期診斷的腫瘤分子標志物的可行性提供理論基礎。

8、　　方法：采用莖環(huán)實時定量熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(Real-time Quantitative PCR)TaqMan探針法檢測2010年10月至2011年5月在廣東省人民醫(yī)院行手術治療并經(jīng)術后病理確診的35例上皮性卵巢癌、15例良性上皮性卵巢腫瘤及10例正常卵巢的組織標本中miRNA-200a、 miRNA-200c的相對表達量。應用免疫組化SP法（鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法）檢測上述組織中TGF-β2、IGF-1R蛋白表達，

9、所有實驗數(shù)據(jù)均使用SPSS.13統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，miRNA-200a、miRNA-200c的相對表達量為計量資料數(shù)據(jù)經(jīng)Kolmogorov-Smirno檢驗為不符合正態(tài)分布，三組間比較用Kruskal-wallis Test，組間兩兩比較用mann-whitney檢驗，以X± S表示。TGF-β2、IGF-1R各組間率的比較采用卡方檢驗或fisher確切概率法檢驗，miRNA-200a、miRNA-200c和TGF-β2、IGF

10、-1R之間的相關性采用Spearman相關分析。雙側(cè)P<0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：1、上皮性卵巢癌組織中miRNA-200a、miRNA-200c的相對表達量(376.80±109.25；392.73±110.11)均高于良性卵巢腫瘤(24.71±6.48；28.33±13.27)及正常卵巢組織(4.65±2.73；3.65±2.01)，差異有顯著的統(tǒng)計學意義(P<0.01)，后兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。上

11、皮性卵巢癌組織中miRNA-200a與miRNA-200c的相對表達量存在正相關關系,差異有顯著的統(tǒng)計學意義（r=0.790，P<0.01）。
　　2、免疫組化SP法檢測TGF-β2、IGF-1R蛋白在上皮性卵巢癌組織中陽性表達率分別為(85.71%；88.57%)，高于卵巢良性腫瘤(40％；46.7%)及正常卵巢(30％；40%)，差異有顯著的統(tǒng)計學意義(P<0.01)，后兩者間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　3、

12、上皮性卵巢癌組織中miRNA-200a相對表達量與TGF-β2、IGF-1R蛋白的表達均存在負相關的關系(r=-0.603； r=-0.531，P<0.01)，差異有顯著的統(tǒng)計學意義。
　　4、miRNA-200a、miRNA-200c的表達與臨床分期進展、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在正相關關系（P<0.05），與卵巢子宮內(nèi)膜樣癌類型存在負相關關系（P<0.05），與組織分化無關。TGF-β2、IGF-1R蛋白的表達均與臨床分期進展呈正相關（P

13、<0.05），TGF-β2蛋白在卵巢漿液性癌病理類型中較其它兩種病理類型高表達，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而與組織分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(P>0.05)。
　　結(jié)論：1、miRNA-200家族在上皮性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展的分子機制中可能具有類似癌基因和抑癌基因的雙重性作用：①miRNA-200家族在上皮性卵巢癌組織較良性卵巢腫瘤及正常卵巢組織的高表達，表明miRNA-200家族在上皮性卵巢癌的發(fā)生中可能發(fā)揮著類似致癌基因的作用

14、。②miRNA-200a、miRNA-200c及其預測靶基因TGF-β2、IGF-1R蛋白在EOC的表達呈負相關，并隨著臨床分期的進展分別呈下降及上升趨勢，提示可能存在IGF-1R/TGF-β2/miRNA-200的信號通路網(wǎng)，不僅高表達的miRNA-200家族可能通過與預測靶基因TGF-β2、IGF-1R結(jié)合，發(fā)生轉(zhuǎn)錄后基因沉默，在翻譯水平抑制TGF-β2、IGF-1R的表達，抑制EMT而誘導MET，抑制癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，表明m

15、iRNA-200家族在EOC的發(fā)展中可能發(fā)揮著類似抑癌基因的作用；而且TGF-β2、IGF-1R也可能可以反過來下調(diào)miRNA-200家族的表達，誘導EMT而抑制MET，促進癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。IGF-1R/TGF-β2/miRNA-200信號通路可能通過調(diào)節(jié)EMT與MET的平衡，參與上皮性卵巢癌的分子相關機制并在病情演變及進展中發(fā)揮重要的作用。
　　2、miRNA-200家族有可能作為一種極具潛力的新一代的腫瘤分子標志物應用