共刺激分子4-1BBL在口腔癌免疫治療中的作用.pdf

1、目的：腫瘤細(xì)胞由于表面缺乏共刺激分子的表達(dá)，無法起始有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答，4-1BBL作為一種重要的共刺激分子，在腫瘤免疫中的作用越來越受到重視，為了充分研究4-1BBL在腫瘤免疫中的作用，我們構(gòu)建了人4-1BBL真核表達(dá)載體Pegfp-4-BBL并轉(zhuǎn)染口腔鱗癌細(xì)胞株，在體外與健康人外周血T淋巴細(xì)胞共同孵育，檢測其在體外腫瘤免疫中的作用。探索建立人口腔鱗癌PBL-SCID鼠嵌合模型，進(jìn)一步評價4-1BBL在人口腔鱗癌PBL-SCID鼠嵌

2、合模型腫瘤免疫中的作用。
　　 方法：⑴構(gòu)建并鑒定真核表達(dá)載體Pegfp-4-1BBL，脂質(zhì)體法將重組載體Pegfp-4-1BBL轉(zhuǎn)染入人口腔鱗癌細(xì)胞Tca8113中，經(jīng)G418(400μg/ml)篩選及有限稀釋法后獲得穩(wěn)定高表達(dá)克隆，分別用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT—PCR)和蛋白質(zhì)印跡法(western blot)檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中h4-1BBLmRNA和蛋白的表達(dá)。通過絲裂霉素處理制各腫瘤細(xì)胞瘤苗。經(jīng)體外與人外周血T淋巴細(xì)胞共同

3、培養(yǎng)后，測定淋巴細(xì)胞特異性殺傷活性，T細(xì)胞增殖水平，T細(xì)胞分型及對淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子白介素-2(IL-2)、干擾素-γ(IFN-γ)的影響。⑵SCID鼠右背部皮下注射5×105(0.2ml)Tca8113細(xì)胞。成瘤后隨機分成4組，尾靜脈注射anti-asialo-GM1多抗。小鼠處死后比較各組小鼠體重及腫瘤、脾臟的重量。RT-PCR檢測4-1BBL基因在瘤體內(nèi)的表達(dá)，HE染色觀察腫瘤及脾臟生長情況。
　　 結(jié)果：①RT—PcR

4、及Western blot檢測出轉(zhuǎn)基因Tca8113細(xì)胞中4-1BBL的表達(dá)轉(zhuǎn)染空載體Pegfp的Tca8113細(xì)胞中，沒有檢測到4-1BBL的表達(dá)。經(jīng)過G418篩選后有限稀釋法建立了4-1BBL／Tca8113細(xì)胞株。經(jīng)MMc處理后，與未轉(zhuǎn)染的Tca8113細(xì)胞相比較，轉(zhuǎn)染人4-1BBL的Tca8113細(xì)胞能夠顯著增強T細(xì)胞增殖， 促進(jìn)IL-2、IFN—γ分泌，并能有效地誘導(dǎo)CTL產(chǎn)生對Tca8113細(xì)胞的特異性殺傷作用。②模型成瘤率

5、為100％，成瘤潛伏期12～18天。免疫重建后第2、7周時人口腔癌PBL—scID嵌合組小鼠血中人IgG分別達(dá)(71 8±13 2)μg/ml、(136 9±15 3)μg/ml。免疫重建及轉(zhuǎn)染4-1BBL基因組小鼠，腫瘤生長受到明顯抑制(p<0.01)。冰凍切片在倒置熒光顯微鏡下圖像及RT-PCR證明4-1BBL基因在瘤體內(nèi)充分表達(dá)，冰凍切片HE染色見腫瘤生長、脾臟有大量淋巴細(xì)胞浸潤。
　　 結(jié)論：轉(zhuǎn)染4-1BBL基因既能增強