負(fù)性協(xié)同刺激分子B7-H4在肺癌免疫逃逸中的作用及其機(jī)制.pdf

1、腫瘤的發(fā)生發(fā)展依賴于其處于的微環(huán)境，其由腫瘤細(xì)胞本身、間質(zhì)細(xì)胞、微血管、組織液及浸潤(rùn)細(xì)胞，如樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等共同組成。作為腫瘤免疫效應(yīng)階段的執(zhí)行場(chǎng)所，腫瘤微環(huán)境內(nèi)存在許多因素參與腫瘤組織與免疫系統(tǒng)的相互作用，包括局部效應(yīng)細(xì)胞功能障礙、抑制性免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞Treg和細(xì)胞因子的免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用、抑制性配體受體反應(yīng)以及腫瘤微環(huán)境中T細(xì)胞代謝活性的負(fù)調(diào)節(jié)等。研究顯示，作為重要的一組參與免疫逃逸的B7家族負(fù)性協(xié)同刺激分子在癌組織中表達(dá)是腫瘤微環(huán)

2、境中極為重要的一個(gè)特質(zhì)，參與構(gòu)建了腫瘤免疫抑制性功能區(qū)。其中，B7-H4是近年來(lái)備受關(guān)注的免疫分子，其通過(guò)抑制T細(xì)胞的增殖、細(xì)胞因子的分泌和細(xì)胞周期的進(jìn)程負(fù)性調(diào)控T細(xì)胞的免疫應(yīng)答，在腫瘤免疫逃逸過(guò)程發(fā)揮著極為重要的作用。本文著重分析了B7-H4分子在腫瘤微環(huán)境中相關(guān)免疫細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞上的表達(dá)，探討其調(diào)節(jié)機(jī)制和生物學(xué)意義，努力揭示其如何介導(dǎo)肺癌免疫逃逸。
　　 論文第一部分采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了人肺癌組織中87-H4分子的表達(dá)

3、，及其和浸潤(rùn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞的相關(guān)性。結(jié)果顯示，在59例NSCLC組織中，B7-H4分子中高表達(dá)27例，比例為45.76％。NSCLC組織中B7-H4分子表達(dá)水平與肺癌臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與患者性別、年齡、腫瘤組織類型、腫瘤大小無(wú)關(guān)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析還顯示，肺癌組織中B7-H4分子的表達(dá)水平和CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)程度呈負(fù)相關(guān)和CD68+細(xì)胞浸潤(rùn)程度呈正相關(guān)；在B7-H4分子與CD68分子均高表達(dá)的肺癌組織中，發(fā)生淋

4、巴結(jié)轉(zhuǎn)移的比例為78.26%，明顯高于兩分子均低表達(dá)的患者(30.4%)。
　　 論文第二部分檢測(cè)了肺瘥患者癌組織、外周血循環(huán)中CD68+細(xì)胞B7-H4分子的表達(dá)，并分析了其臨床意義。結(jié)果顯示，人肺癌組織中浸潤(rùn)了大量的CD68+細(xì)胞，其表面廣泛存在B7-H4分子的表達(dá)；肺癌患者外周血CD68+細(xì)胞上B7-H4表達(dá)率為32.39±4.71%，CD68+B7-H4+細(xì)胞占總CD68+細(xì)胞比例為20.59±2.46%，明顯高于肺結(jié)核患

5、者和健康志愿者。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，CD68+細(xì)胞上B7-H4分子表達(dá)水平和CD68+B7-H4+細(xì)胞數(shù)量與肺癌患者性別、年齡、腫瘤類型無(wú)關(guān)，和腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期相關(guān)。本部分還在小鼠肺癌模型中進(jìn)一步探討了腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞上B7-H4分子的調(diào)節(jié)因素和生物學(xué)意義。結(jié)果顯示，正常小鼠腹腔來(lái)源巨噬細(xì)胞微弱表達(dá)B7-H4分子，荷瘤小鼠腹腔來(lái)源巨噬細(xì)胞和荷瘤小鼠腫瘤組織浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞均高表達(dá)B7-H4分子，這和此前在肺癌患者外周血的檢測(cè)結(jié)果

6、相一致。體外采用IL-10刺激巨噬細(xì)胞，B7-H4分子可出現(xiàn)出現(xiàn)上調(diào)性表達(dá)。肺癌細(xì)胞分泌IL-10，亦可以上調(diào)巨噬纓脆上B7-H4分子的表達(dá)，當(dāng)加入中和性IL-10單抗后，肺癌細(xì)胞培養(yǎng)上清上調(diào)巨噬細(xì)胞表面B7-H4分子表達(dá)的作用被部分阻斷。B7-H4信號(hào)封閉后，巨噬細(xì)胞促進(jìn)了T細(xì)胞IFN-γ的分泌，減少了IL—10的分泌。
　　 論文第三部分在小鼠肺癌模型中探討了肺癌細(xì)胞上B7-H4分子的表達(dá)及其調(diào)節(jié)因素。結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)的L

7、LC細(xì)脆中存在B7-H4分子mRNA的表達(dá)，但其蛋白質(zhì)水平的表達(dá)不位于膜表面，而是在胞內(nèi)。荷瘤小鼠腫瘤組織來(lái)源的腫瘤細(xì)胞不同程度表達(dá)B7-H4分子，其中成瘤1W的小鼠腫瘤組織來(lái)源的LLC細(xì)胞膜表面B7-H4分子的表達(dá)水平顯著低于成瘤2w的小鼠。此外，本部分研究進(jìn)一步觀察了TAM對(duì)肺癌細(xì)胞表面B7-H4的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明，采用TAM上清培養(yǎng)LLC細(xì)胞48h、72h后，LLC細(xì)胞膜表面B7-H4分子的表達(dá)逐漸上調(diào)。ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，

8、和正常小鼠腹腔來(lái)源巨噬細(xì)胞相比，肺癌組織來(lái)源的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)分泌高水平的TNF-α和IL-10，但I(xiàn)FN-γ分泌水平低下。為證實(shí)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)來(lái)源的TNF-α和IL-10參與LLC細(xì)胞膜表面B7-H4分子的表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)采用重組TNF-α、IL-10分別刺激LLC細(xì)胞48h、72h小時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LLC膜表面B7-H4分子表達(dá)亦逐漸上調(diào)，而正常巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清不能上調(diào)LLC細(xì)胞膜表面B7-H4分子表達(dá)

9、。JAM法檢測(cè)結(jié)果表明LLC細(xì)胞上B7-H4分子可拮抗CTL的殺傷作用；ELISA檢測(cè)表明，LLC細(xì)胞上表達(dá)的B7-H4分子抑制CTL分泌INF-γ;凋亡實(shí)驗(yàn)分析顯示，LLC細(xì)胞上表達(dá)的B7-H4分子介導(dǎo)了T細(xì)胞凋亡；腫瘤免疫治療實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,B7-H4單抗治療組小鼠腫痛形成延緩，成瘤時(shí)間晚于對(duì)照組小鼠。以上結(jié)果提示，TAM來(lái)源的TNF-α、IL-10可刺激LLC細(xì)胞膜表面B7-H4分子的表達(dá)，增加了其腫瘤原性，抑制了T綱胞的功能，介導(dǎo)

10、了免疫逃逸。
　　 論文第四部分探討了腫瘤浸潤(rùn)樹突狀細(xì)胞上B7-H4分子的表達(dá)及其生物學(xué)意義。結(jié)果顯示，小鼠骨髓來(lái)源的不同分化發(fā)育階段的DCs均有不同程度B7-H4的表達(dá)，未成熟DCs表面較高水平表達(dá)B7-H4（60.4%±8.9%），在IL-10作用下其表達(dá)水平進(jìn)一步上調(diào)（85.4%±7.5%），未成熟DCs經(jīng)TNF-α刺激48h后，B7-H4的表達(dá)水平顯著下調(diào)（30.4%±3.9%）。Westernblot檢測(cè)結(jié)果表明，DC

11、經(jīng)TNF-α刺激15min后，ERK1/2分子即出現(xiàn)磷酸化；流式綱胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，imDC在TNF-α、IL-10同時(shí)刺激48h后，B7-H4分子表達(dá)水平為（35.4%±4.1%），這提示TNF-α可介導(dǎo)DC的成熟，并拮抗IL-10對(duì)B7-H4分子的上調(diào)作用。在腫瘤組織，CD11c陽(yáng)性細(xì)胞高表達(dá)B7-H4分子(91.4%±5.4%)，相關(guān)細(xì)胞因子的檢測(cè)結(jié)果表明，腫瘤微環(huán)境中存在大量IL-10、TNF-α，面IFN-γ水平低下。這提示在

12、腫瘤微環(huán)境中TNF-α不能拮抗IL-10對(duì)DC上B7-H4分子的上調(diào)作用。MLR結(jié)果顯示，imDC、IL-10-4reatedDCs對(duì)T細(xì)胞的活化和增殖激發(fā)作用不明顯，當(dāng)加入抗B7-H4阻斷型單抗后，可明顯地促進(jìn)DCs對(duì)T細(xì)胞的增殖，這表明阻斷B7-H4分子可增強(qiáng)處于抑制狀態(tài)DCs的免疫刺激活性。相比之下，mDC對(duì)T細(xì)胞的促增殖作用明顯，加入抗B7-H4阻斷型單抗亦畿增加mDCs對(duì)T細(xì)胞的促增殖作用，但作用較弱。收集IL-10=trea