B7-H4在非小細胞肺癌中表達及其在T淋巴細胞免疫調節(jié)中作用的研究.pdf

1、背景與目的:
　　 非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌常見的類型，預后較差，治療易耐藥。免疫治療是近年來科學工作者廣泛認同的較為理想的腫瘤治療方法，但免疫治療對NSCLC的療效甚微，其療效的提高有賴于對腫瘤局部免疫微環(huán)境的深入了解。B7-H4是共刺激分子，參與T淋巴細胞介導免疫應答的負性調控。大部分的人類腫瘤細胞表面表達B7-H4。B7-H4與NSCLC的相關性研究，目前國內外

2、研究主要集中在B7-H4表達與NSCLC的臨床病理及預后的相關性，而B7-H4表達對NSCLC的生物學行為和免疫反應有何影響尚未見報道，其在細胞內相關信號通路及調控機理尚待深入研究。我們的研究首先探討B(tài)7-H4在NSCLC組織中的表達及其與臨床病理及預后的關系，進一步檢測人NSCLC細胞系中B7-H4基因mRNA的表達狀況及構建B7-H4特異的RNA干擾(RNAi)質粒載體，研究NSCLC B7-H4基因表達沉默對細胞增殖、侵襲、黏附和

3、細胞周期的影響，并與Jurkat細胞共培養(yǎng)，探討B(tài)7-H4分子對免疫反應中T淋巴細胞功能的影響。最后探討IFN-α和IFN-γ對A549細胞B7-H4mRNA和蛋白表達的影響。為今后進一步研究B7-H4表達調控機理，進而研究B7-H4在細胞內相關信號通路，為腫瘤免疫干預提供新的思路。
　　 方法:
　　 1、收集102例NSCLC患者的癌組織標本及臨床病例資料，免疫組織化學法檢測NSCLC組織中B7-H4蛋白的表達以及T

4、淋巴細胞亞群的浸潤，分析B7-H4的表達與NSCLC患者臨床病理特征及T淋巴細胞浸潤的相關性。
　　 2、RT-PCR法檢測人NSCLC細胞株SPCA-1、GLC-82、A549中B7-H4基因mRNA的表達。
　　 3、將B7-H4短發(fā)夾狀RNA(short hairpin RNA，shRNA)序列克隆到質粒pGCsi-U6/Neo載體，采用脂質體介導的轉染方法將構建的B7-H4 shRNA表達質粒轉入A549細胞，建

5、立穩(wěn)定轉染細胞株。RT-PCR、Western Blot檢測B7-H4基因表達沉默前后細胞的B7-H4表達變化，MTT實驗以及平板克隆形成實驗觀察B7-H4基因表達沉默對A549細胞增殖能力影響，Transwell小室實驗檢測B7-H4基因表達沉默對A549細胞的遷移能力影響，流式細胞儀檢測B7-H4基因表達沉默對A549細胞的細胞周期影響。
　　 4、將Jurkat細胞與B7-H4基因表達沉默的A549細胞共培養(yǎng)，MTT法檢測

6、B7-H4基因表達沉默對共培養(yǎng)的Jurkat細胞抑制的影響，流式細胞術檢測B7-H4基因表達沉默對Jurkat細胞的細胞周期影響，RT-PCR、Western Blot檢測B7-H4基因表達沉默對Jurkat細胞的細胞因子IL-2及IL-10影響。
　　 5、用不同濃度(100、500、1000、2000U·ml-1)的IFN-α和IFN-γ分別處理A549細胞，RT-PCR、Western Blot檢測IFN-α和IFN-γ對

7、A549細胞的B7-H4表達的影響。
　　 結果:
　　 1、102例NSCLC組織中，B7-H4表達的陽性率為56.9％，B7-H4可表達于肺癌細胞的胞膜、胞漿內或二者均有表達，陽性者表達強度大部分在(++)以上。不同年齡、性別、吸煙史或分化程度患者B7-H4陽性表達率間均無顯著性差異（P＞0.05）;發(fā)生淋巴結轉移和未發(fā)生淋巴結轉移患者B7-H4的陽性表達率間有顯著性差異（P＜0.05），B7-H4陽性TILs的數(shù)量

8、低于B7-H4陰性TILs的數(shù)量(P＜0.05）。
　　 2、B7-H4基因在人NSCLC細胞株SPCA-1、GLC-82、A549中呈陽性表達。
　　 3、成功構建質粒表達載體能有效地干擾A549細胞B7-H4mRNA和蛋白質表達水平。RT-PCR和Western Blot檢測顯示陽性轉染組B7-H4表達較空白對照組、空載質粒組降低。MTT結果表明隨著細胞培養(yǎng)時間的逐漸延長，陽性轉染組細胞的細胞增殖抑制率遞增，較空白對

9、照組及空載質粒組細胞存在顯著差異(P＜0.05)，而空白對照組和空載質粒組間無顯著差異（P＞0.05）。平板克隆形成實驗結果顯示陽性轉染組的克隆形成數(shù)為158.3±9.452，明顯低于空白對照組（克隆形成率為243.3±12.34）(P＜0.05)。Transwell小室實驗結果顯示與空白對照組（遷移細胞數(shù)為128.32±10.50）以及空載質粒組(遷移細胞數(shù)為119.35±4.73)相比，陽性轉染組的遷移細胞數(shù)（87.67±9.07）

10、明顯減少(P＜0.05)。與空白對照組（穿過基底膜細胞數(shù)為39.72±3.50）以及空載質粒組(穿過基底膜細胞數(shù)為37.01±1.74)相比，陽性轉染組的穿過基底膜細胞數(shù)（23.14±2.08）減少（P＜0.05）?？瞻讓φ战M、空載質粒組和陽性轉染組三組A549細胞株經流式細胞儀檢測細胞周期，陽性轉染組G0/G1期和G2/M期細胞數(shù)量分別為35.51±4.11％和35.37±1.87％，空白對照組（G0/G1期和G2/M期細胞數(shù)量分別為

11、31.22±3.34％和44.72±2.41％）及空載質粒組（G0/G1期和G2/M期細胞數(shù)量分別為30.42±2.45％和45.04±2.69％），提示陽性轉染組A549細胞呈G0/G1期阻滯，而G2/M期細胞數(shù)量分布減少，細胞增殖受抑。
　　 4、MTT實驗結果顯示隨著時間的延長，與陽性轉染組共培養(yǎng)的Jurkat細胞的細胞增殖能力明顯較與空白對照組及空載質粒組共培養(yǎng)的Jurkat細胞增高(P＜0.05)。細胞生長至48h，與

12、陽性轉染組共培養(yǎng)的Jurkat細胞細胞增殖抑制率明顯超過與空載質粒組和空白對照組共培養(yǎng)的Jurkat細胞(P＜0.05)。而空白對照組和空載質粒組間比較無顯著差異(P＞0.05)。流式細胞儀結果顯示與陽性轉染組共培養(yǎng)的Jurkat細胞的G0/G1期細胞為37.28±3.35％，明顯低于空白對照組（63.36±5.45％）以及空載質粒組(66.05±6.02％)(P＜0.05);與陽性轉染組共培養(yǎng)的Jurkat細胞的S+G2/M期細胞為6

13、2.76±5.56％，明顯高于空白對照組（36.65±3.28％）以及空載質粒組(33.92±3.64％)(P＜0.05)。與陽性轉染組共培養(yǎng)的Jurkat細胞的細胞凋亡水平為0.27±0.07％，明顯低于空白對照組（5.36±0.45％）以及空載質粒組（6.14±0.36％）（P＜0.05），空白對照組和空載質粒組細胞凋亡水平無顯著差異（P＞0.05）。RT-PCR結果顯示與陽性轉染組共培養(yǎng)的Jurkat細胞的IL-10和IL-2mR

14、NA表達量分別為1.12±0.12和1.21±0.02，均明顯高于空白對照組（0.89±0.09和0.89±0.09）以及空載質粒組(0.91±0.08和0.87±0.08)(P＜0.05);同時，Western Blot結果顯示陽性轉染組組的IL-10和IL-2蛋白表達分別為1.98±0.02和1.46±0.02均明顯高于空白對照組(0.89±0.09和0.92±0.09)以及空載質粒組(0.87±0.08和0.93±0.09)(P＜

15、0.05)。
　　 5、隨著IFN-α濃度的增加，A549細胞B7-H4mRNA表達增強，組間相比差異具有顯著差異(F=13.30，P＜0.05)。而隨著IFN-γ濃度的增加，A549細胞B7-H4mRNA表達變化組間相比差異無顯著性(F=16.54，P＞0.05)。隨著IFN-α濃度的增加，B7-H4蛋白表達增強，組間相比差異具有顯著性(F=18.69，P＜0.05)，而隨著IFN-γ濃度的增加，A549細胞B7-H4蛋白表達

16、變化不明顯，組間相比無明顯差異(F=17.46，P＞0.05)。
　　 結論:
　　 1、B7-H4在NSCLC組織中高表達，且B7-H4表達水平與NSCLC淋巴結轉移呈正相關，與肺癌組織CD3+T淋巴細胞浸潤程度呈負相關，B7-H4可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。
　　 2、SPCA-1、GLC-82、A549細胞表達B7-H4基因。
　　 3、成功構建靶向B7-H4基因的shRNA表達載體，轉染

17、A549細胞，能有效抑制細胞的B7-H4mRNA和蛋白表達。抑制B7-H4基因可抑制A549細胞的增殖，抑制A549細胞的遷移能力，降低A549細胞的侵襲能力，經流式細胞儀檢測細胞周期，抑制B7-H4基因可使A549細胞G0/G1期阻滯，而G2/M期細胞數(shù)量分布減少，細胞增殖受抑制。
　　 4、B7-H4基因表達沉默能夠有效增加T淋巴細胞的增殖能力。B7-H4基因表達沉默可以減少T淋巴細胞細胞凋亡，有效上調T淋巴細胞的IL-10