原發(fā)性肝癌中B7-H4的高表達(dá)對T細(xì)胞免疫抑制的研究.pdf

1、目的：原發(fā)性肝癌（primary liver cancer，PLC）是我國常見的惡性腫瘤之一，其死亡率在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中高居第3位，具有發(fā)病隱匿、進(jìn)展迅速、治療困難、死亡率高等特點(diǎn)，成為世界范圍內(nèi)惡性腫瘤高發(fā)病率和死亡率的主要因素，當(dāng)前治療原發(fā)性肝癌的方式主要是以手術(shù)切除為主，結(jié)合術(shù)前或術(shù)后放化療，微創(chuàng)治療及生物治療的模式。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展及對腫瘤研究的不斷深入，惡性腫瘤的免疫靶向治療方式成為目前研究的熱點(diǎn)，其中T細(xì)胞免疫和B7

2、家族中負(fù)性共刺激分子 B7-H4在腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展過程中的免疫應(yīng)答越來越受到重視。
　　在腫瘤免疫應(yīng)答過程中T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫起關(guān)鍵作用，T淋巴細(xì)胞活化及抗原特異性 T細(xì)胞免疫應(yīng)答的產(chǎn)生及維持至少需要2個(gè)信號：第一信號由位于抗原提呈細(xì)胞(APC)上的抗原肽-組織相容性抗原（MHC）與T細(xì)胞表面的受體（TCR）相互識別作用產(chǎn)生；第二信號由位于APC上的刺激分子與T細(xì)胞上相對應(yīng)的受體結(jié)合產(chǎn)生，又稱協(xié)同共刺激信號。共刺激信號傳導(dǎo)途徑一

3、方面增強(qiáng) T細(xì)胞免疫應(yīng)答過程中的正性第二信號，另一方面下調(diào) T細(xì)胞免疫應(yīng)答過程中的負(fù)性第二信號，在缺少TCR第二信號的情況下，會(huì)導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞克隆無能或抑制T淋巴細(xì)胞的活化與功能,最終導(dǎo)致免疫抑制及免疫逃逸。負(fù)性共刺激分子 B7-H4屬于B7免疫球蛋白超家族，目前研究表明在腫瘤中B7-H4對T細(xì)胞免疫應(yīng)答具有顯著的負(fù)性調(diào)節(jié)作用，目前是腫瘤免疫治療的研究熱點(diǎn)。
　　對于該課題，我們課題組前期已經(jīng)作了一些相關(guān)研究并取得一定成果：（1）

4、采用免疫熒光技術(shù)對80例人原發(fā)性肝癌和癌旁組織，20例正常肝組織中B7-H4的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)檢測。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明:人原發(fā)性肝癌組織中B7-H4的表達(dá)顯著高于肝癌旁組織和正常肝組織。（2）采用熒光免疫組化染色檢測80例人肝癌組織中B7-H4的表達(dá)與CD4+T、CD8+T細(xì)胞浸潤程度及功能性細(xì)胞因子TGF-β1、IFN-γ分泌相關(guān)性。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明：人原發(fā)性肝癌組織中B7-H4的表達(dá)水平與肝癌內(nèi)CD4+T。CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤程度，

5、功能性細(xì)胞因子TGF-β1和IFN-γ分泌均呈負(fù)相關(guān)。（3）采用Western Blot技術(shù)檢測人原發(fā)性肝癌及癌旁組織中純化分離出CD8+T細(xì)胞中B7-H4，IFN-γ及自噬上游信號通路PI3K-AKT-mTOR相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明：與癌旁組織相比，肝癌組織純化分離出CD8+T細(xì)胞中B7-H4表達(dá)明顯上調(diào)，細(xì)胞因子 IFN-γ表達(dá)明顯下降； CD8+T細(xì)胞中P-AKT/AKT,P-mTOR/mTOR比值上升。提示原發(fā)性肝癌組織

6、CD8+T中 B7-H4表達(dá)上調(diào)可能通過PI3K/AKT/mTOR信號通路促進(jìn)CD8+T細(xì)胞發(fā)生異常自噬。
　　結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本次實(shí)驗(yàn)主要檢測從人原發(fā)性肝癌及癌旁組織中純化分離出CD8+T細(xì)胞中的自噬下游信號通路中ATG7、ATG5-ATG12、LC3I、LC3II相關(guān)蛋白及ATG7 mRNA、LC3II mRNA的表達(dá)情況，探討人原發(fā)性肝癌組織中B7-H4高表達(dá)對T細(xì)胞免疫抑制的影響。
　　方法：
　　本次實(shí)驗(yàn)首

7、先采用免疫磁珠分選技術(shù)從同一來源的新鮮人原發(fā)性肝癌組織及癌旁組織中純化分離出CD8+T細(xì)胞，一方面利用Western Blot技術(shù)分別檢測兩組CD8+T細(xì)胞中自噬下游信號通路中ATG7、ATG5-ATG12、LC3I、LC3II相關(guān)蛋白的表達(dá)情況；另一方面利用熒光定量PCR技術(shù)分別檢測兩組CD8+T細(xì)胞中ATG7及自噬標(biāo)志性蛋白LC3II的mRNA表達(dá)情況。應(yīng)用SPSS13.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用的統(tǒng)計(jì)方法為：兩樣本的t檢

8、驗(yàn)，在 P<0.05時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從而探討人原發(fā)性肝癌組織中B7-H4高表達(dá)對T細(xì)胞免疫抑制的影響。
　　結(jié)果：
　?。?）自噬相關(guān)蛋白 LC3I在原發(fā)性肝癌 CD8+T細(xì)胞中的表達(dá)明顯低于癌旁組織，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.72，P=0.001）。
　?。?）自噬標(biāo)志性蛋白LC3II在原發(fā)性肝癌CD8+T細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.68，P=0.001）。
　?。?）自噬

9、相關(guān)蛋白ATG7在原發(fā)性肝癌CD8+T細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.49，P=0.004）。
　?。?）自噬相關(guān)蛋白ATG5-ATG12在原發(fā)性肝癌CD8+T細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.72，P=0.003）。
　?。?）ATG7 mRNA在原發(fā)性肝癌CD8+T細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t，=4.14，P=0.025）。
　?。?）LC3

10、II mRNA在原發(fā)性肝癌CD8+T細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.29，P=0.005）。
　　結(jié)論：
　　自噬下游信號通路中 ATG7、ATG5-ATG12、LC3II相關(guān)蛋白的表達(dá)在原發(fā)性肝癌組織 CD8+T細(xì)胞中明顯高于癌旁組織，自噬相關(guān)蛋白 LC3I的表達(dá)在原發(fā)性肝癌組織CD8+T細(xì)胞中明顯低于癌旁組織；同時(shí)，ATG7及LC3II的mRNA的表達(dá)在原發(fā)性肝癌組織CD8+T細(xì)胞中明顯高于癌旁