B7-H4在膽管癌免疫逃逸中的作用和臨床意義的初步研究.pdf

1、一、研究背景
　　膽管癌作為一種常見的惡性腫瘤，發(fā)病率在我國消化系統(tǒng)腫瘤中排名第五，其發(fā)病率每年仍有增高的趨勢。流行病學調(diào)查顯示膽管癌患者發(fā)病年齡多為50-60歲，男性多于女性。膽管癌的發(fā)病率具有一定民族和區(qū)域分布差異，多發(fā)生亞洲，特別是東南亞以及中東國家，我國主要是華南以及東南沿海發(fā)病率較高。近些年，隨著環(huán)境不斷惡化以及臨床診斷技術的發(fā)展進步，世界范圍內(nèi)膽管癌發(fā)病率的呈逐年上升趨勢。盡管膽管癌的發(fā)病率仍低于消化系統(tǒng)其他惡性腫瘤，

2、但是患者的死亡率卻一直處于較高水平。膽管癌所處的特殊解剖部位以及高侵襲轉(zhuǎn)移能力，是造成高死亡率的主要原因。目前針對膽管癌的治療方法中，膽管癌根治性切除術是提高患者預后降低死亡率的主要手段。但是由于膽管癌起病隱匿、臨床表現(xiàn)不典型以及缺乏早期診斷標志物，部分患者就診時腫瘤已經(jīng)進入晚期，有些甚至已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移，因而失去了手術切除腫瘤的最佳時機。部分膽管癌患者即使接受根治性手術切除，腫瘤復發(fā)以及轉(zhuǎn)移的風險仍然偏高。以上這些因素嚴重影響了膽管癌根治

3、性切除術的遠期療效。近年來，針對膽管癌發(fā)生、發(fā)展的相關分子機制研究已經(jīng)取得一定的進展，但是涉及到膽管癌的免疫逃逸以及侵襲轉(zhuǎn)移的相關研究還不是很完善。所以我們把研究的重點放在了膽管癌的腫瘤微環(huán)境，特別是免疫逃逸以及侵襲轉(zhuǎn)移的相關研究上。通過相關內(nèi)容的研究，我們嘗試發(fā)現(xiàn)新的分子以及相關通路作為診斷和治療靶點，并且能夠為創(chuàng)新臨床診斷和治療的方法提供理論依據(jù)。
　　T細胞免疫作為腫瘤微環(huán)境中抗腫瘤免疫的重要組成部分，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起

4、到十分關鍵的作用。其中T細胞的活化和增殖需兩種信號途徑。第一條信號途徑是抗原遞呈細胞通過呈遞抗原肽并且與T細胞受體識別，傳遞活化信號。第二條信號途徑是通過協(xié)同刺激信號分子活化T細胞。協(xié)同刺激分子決定了T細胞是被激活并且增殖還是轉(zhuǎn)為抑制或者無應答狀態(tài)。目前所知的協(xié)同刺激分子主要分為三類：腫瘤壞死因子家族、細胞因子家族以及B7家族。其中B7家族包括了B7-1、B7-2、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-DC和B7-H4。B7家族作為

5、重要的協(xié)同刺激分子，它們不僅能起到促進T細胞增殖活化以及產(chǎn)生細胞因子的作用，同時也能起到抑制、限制或者減弱 T細胞反應的作用。B7-H4作為協(xié)同刺激分子B7家族中的成員，主要提供負性調(diào)節(jié)信號，通過抑制T細胞增殖、分泌相關細胞因子以及降低T細胞殺傷腫瘤細胞能力，從而促進腫瘤細胞逃過宿主免疫監(jiān)視進而發(fā)生免疫逃逸現(xiàn)象；同時，B7-H4在部分腫瘤中特異性表達，還可以增強腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力，促進腫瘤細胞惡性轉(zhuǎn)化。既往文獻報道，B7-H4在多種腫

6、瘤中存在異常表達，并且與腫瘤臨床病理指標以及病人預后密切相關。
　　由于B7-H4在協(xié)助腫瘤細胞逃避機體免疫監(jiān)視以及腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到了十分重要的作用。根據(jù)既往研究成果以及前期研究結(jié)果，對B7-H4在膽管癌免疫逃逸中的作用和臨床意義進行初步研究，并提出研究假設：B7-H4在膽管癌患者中特異性表達增高，并且通過抑制腫瘤微環(huán)境中的免疫淋巴細胞，降低對腫瘤細胞的殺傷能力，從而促進腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸。同時B7-H4還可促進膽管癌細胞發(fā)生

7、惡性轉(zhuǎn)化，增強癌細胞自身侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　二、研究方法
　　為了驗證上述假設，首先，通過免疫組化檢測統(tǒng)計B7-H4在膽管癌病人中的表達情況，分析其表達水平與臨床病理特征以及患者預后的關系，并分析腫瘤組織和非腫瘤組織中B7-H4的差異表達的情況；其次，通過免疫組化分別統(tǒng)計腫瘤實質(zhì)和間質(zhì)中 CD4，CD8陽性T淋巴細胞浸潤情況與B7-H4陽性表達之間的聯(lián)系，分析B7-H4是否抑制T淋巴細胞在腫瘤微環(huán)境中浸潤的情況；再次，在體外

8、試驗中干擾B7-H4在腫瘤細胞中的表達，分析B7-H4表達水平的改變對細胞毒性淋巴細胞的殺傷作用和相關細胞因子分泌情況的影響。最后，通過下調(diào)B7-H4在膽管癌細胞中表達水平，觀察膽管癌細胞侵襲和遷移能力的變化情況。本項研究目的在于探討B(tài)7-H4在膽管癌中的表達情況以及相關臨床意義，以及它如何促進膽管癌細胞在腫瘤微環(huán)境中發(fā)生免疫逃逸以及惡性轉(zhuǎn)化，尤其是增強癌細胞侵襲遷移能力的可能機制，開拓膽管癌發(fā)生腫瘤免疫逃逸以及侵襲轉(zhuǎn)移的研究思路，為發(fā)

9、現(xiàn)新的膽管癌預后指標以及新的免疫治療靶點提供科學研究依據(jù)。
　　1.收集從2005年至2012年第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院肝膽外科研究所進行根治性切除并經(jīng)病理診斷明確為膽管癌的病例。上述收集的病例均未進行放療或者化療。同時收集19例慢性膽管炎、8例膽管腺瘤標本和18例膽管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織標本。收集的臨床資料包括病人性別、年齡、腫瘤位置、大小、分化程度、分期分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠處轉(zhuǎn)移的情況。采用免疫組化的方法檢測 B7-H4在各種組織中

10、的表達情況，并對比腫瘤組織和非腫瘤組織中B7-H4的表達差異；同時分析B7-H4與患者臨床病理特征的相關性。
　　2.收集110例膽管癌患者腫瘤組織，進行免疫組化染色，檢測統(tǒng)計CD4、CD8陽性T淋巴細胞分別在腫瘤實質(zhì)以及腫瘤間質(zhì)組織中的浸潤表達情況，并結(jié)合對應患者的B7-H4表達情況，分析B7-H4與CD4、CD8陽性T淋巴細胞表達情況的相關性。
　　3.收集110例膽管癌患者臨床隨訪資料（包括患者術后總存活時間和無瘤生存

11、時間）?？偵鏁r間的計算方式是從病人手術時間到病人死亡時間或者最后一次聯(lián)系隨訪時間；無瘤生存時間的計算方式是從病人手術時間到發(fā)現(xiàn)腫瘤復發(fā)的時間。腫瘤的復發(fā)主要依靠影像學以及病理診斷為主。單因素生存分析采用KM法（KM method），多因素分析采用Cox多因素逐步回歸（向前，極大似然法）。分析B7-H4在腫瘤組織中的表達與患者預后之間的關系。
　　4.選擇膽管癌細胞株QBC939和RBE作為研究對象，利用慢病毒作為載體，構建shR

12、NA-B7-H4序列，下調(diào)兩株細胞中 B7-H4的表達水平，然后將其與細胞毒性 T淋巴細胞共培養(yǎng)，觀察細胞毒性T淋巴細胞對膽管癌細胞殺傷作用的變化情況。同時還檢測共培養(yǎng)后培養(yǎng)基上清液相關細胞因子分泌水平的變化情況。
　　5.選擇膽管癌細胞株 QBC939和RBE作為研究對象，利用慢病毒作為載體，構建shRNA-B7-H4序列，下調(diào)兩株細胞中 B7-H4的表達水平，然后通過觀察兩株膽管癌細胞的損傷修復實驗、Transwell侵襲實驗

13、，觀察B7-H4表達對膽管癌細胞侵襲和遷移能力的影響。
　　三、研究結(jié)果
　　1.在110例患者的膽管癌組織中，54例呈B7-H4染色陽性，陽性率為49％；8例膽管腺瘤組織中，全部呈 B7-H4染色陰性；19例慢性膽管炎組織中，4例呈 B7-H4染色陽性，陽性率為21.1%。本部分結(jié)果提示：B7-H4在腫瘤組織中表達的陽性率明顯高于非腫瘤組織，B7-H4在膽管癌組織中表達異常增高。通過分析B7-H4表達情況和患者臨床病理特征

14、的相關性發(fā)現(xiàn)：B7-H4的表達與腫瘤分期，分級和淋巴轉(zhuǎn)移有關；而與性別、年齡、部位，遠處轉(zhuǎn)移無關。本部分結(jié)果提示：B7-H4的異常表達可能與腫瘤惡性程度以及侵襲轉(zhuǎn)移相關。
　　2.在110例患者的膽管癌腫瘤間質(zhì)組織中，CD4陽性T淋巴細胞輕度浸潤97例，重度浸潤13例；CD8陽性T淋巴細胞輕度浸潤56例，重度浸潤54例。在110例患者的膽管癌腫瘤實質(zhì)組織中，CD4陽性T淋巴細胞輕度浸潤88例，重度浸潤22例；CD8陽性T淋巴細胞輕

15、度浸潤76例，重度浸潤34例。膽管癌組織中B7-H4的表達水平與 CD8陽性 T淋巴細胞在腫瘤間質(zhì)細胞浸潤程度有關。本部分結(jié)果提示：B7-H4分子作為一個負性免疫調(diào)控分子，可能通過降低CD8陽性T淋巴細胞在腫瘤間質(zhì)細胞浸潤的程度，從而在促進膽管癌細胞發(fā)生免疫逃逸中起到重要作用。
　　3.通過對110膽管癌患者生存數(shù)據(jù)的統(tǒng)計。Kaplan—Meier模型分析提示：B7-H4陽性組患者生存時間明顯低于B7-H4陰性組患者。按照相同方法

16、發(fā)現(xiàn)：B7-H4陽性組患者復發(fā)時間明顯低于B7-H4陰性組患者。為了排除相關混雜因素的干擾，將患者年齡、性別、腫瘤部位、分化程度以及B7-H4表達情況帶入Cox模型中進行術后存活時間以及復發(fā)時間的多因素相關性分析。結(jié)果顯示：B7-H4陽性表達是判定患者術后存活時間和復發(fā)時間的一個相對獨立危險因素。本部分結(jié)果提示：B7-H4陽性表達與膽管癌患者預后較差顯著相關而且可以作為判斷患者預后的獨立分子標志物。
　　4.通過Western-b

17、lot方法檢測，發(fā)現(xiàn)：兩株膽管癌細胞株QBC939和RBE均有 B7-H4蛋白的表達。采用慢病毒轉(zhuǎn)染 shRNA-B7-H4進入細胞株，成功下調(diào)B7-H4表達水平；在效靶比為（20:1或者10:1）時，特異性CD8+CTL對B7-H4表達水平下調(diào)的膽管癌細胞殺傷能力明顯高于對照組的殺傷能力。淋巴細胞和B7-H4表達水平下調(diào)的膽管癌細胞株混合培養(yǎng)后，TGF-β，IL-6細胞因子分泌水平明顯低于對照組。本部分結(jié)果提示 B7-H4有可通過能增

18、強細胞因子 TGF-β，IL-6的分泌水平，誘導CD8陽性T分化為不具有細胞毒性Th17，從而降低CD8+CTL對腫瘤細胞的殺傷能力。
　　5．采用慢病毒轉(zhuǎn)染shRNA-B7-H4進入細胞株，成功下調(diào)B7-H4表達水平；通過觀察損傷修復實驗、Transwell侵襲實驗發(fā)現(xiàn)下調(diào)膽管癌細胞中B7-H4蛋白表達水平能明顯抑其癌細胞侵襲和遷移能力。本部分結(jié)果提示：B7-H4明顯促進了膽管癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　四、研究結(jié)論