協(xié)同刺激分子B7-H1調(diào)控IFIT2的機(jī)制及其在食管癌中的應(yīng)用.pdf

1、近年來，對腫瘤微環(huán)境和腫瘤免疫逃逸機(jī)制的深入研究發(fā)現(xiàn)，一組介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)的重要分子—免疫卡控點(diǎn)，如B7家族負(fù)性協(xié)同刺激分子:B7同系物1(B7 homolog1，B7-H1)可異常表達(dá)于人類腫瘤組織及腫瘤浸潤的免疫細(xì)胞，參與了腫瘤免疫逃逸，并且與患者的臨床病理參數(shù)及預(yù)后密切相關(guān)，是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分。三角形四肽重復(fù)干擾素誘導(dǎo)蛋白2(interferon-induced proteins with tetratricopeptide

2、repeats2，IFIT2)是對腫瘤、病毒和各種藥物最敏感的干擾素刺激基因。IFIT2可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。然而，對IFIT2的生物學(xué)功能和其在腫瘤發(fā)展中的機(jī)制尚不明確。
　　我們使用慢病毒轉(zhuǎn)染及基因干擾技術(shù)構(gòu)建了食管癌細(xì)胞株Eca-109中B7-H1表達(dá)下調(diào)的模型LV-B7-H1-shRNA，采用基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在LV-B7-H1-shRNA的Eca-109細(xì)胞中IFIT2 mRNA水平顯著上升，但目前B7-H1與IFIT2在腫瘤

3、中作用機(jī)制尚不明確。在本課題中，我們采取食管癌作為研究載體，①檢測IFIT2和B7-H1在食管癌組織中的表達(dá)，探討IFIT2、B7-H1的關(guān)系及IFIT2與食管癌患者臨床指標(biāo)及預(yù)后的關(guān)系;②分別檢測B7-H1基因干擾及過表達(dá)對食管癌細(xì)胞系Eca-109細(xì)胞中IFIT2啟動子活性的影響，探討食管癌細(xì)胞中B7-H1對IFIT2啟動子的調(diào)控機(jī)制;③分別檢測B7-H1基因干擾及過表達(dá)對食管癌細(xì)胞系Eca-109細(xì)胞中STAT1、STAT1磷酸化

4、及IFIT2表達(dá)水平的影響，抑制JAK及STAT1后檢測Eca-109細(xì)胞中IFIT2mRNA水平，探討B(tài)7-H1通過JAK-STAT通路調(diào)控IFIT2的機(jī)制。通過以上工作來探討B(tài)7-H1在食管癌中調(diào)控IFIT2的作用機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　(1)IFIT2主要表達(dá)于食管癌細(xì)胞及食管上皮細(xì)胞的細(xì)胞漿和細(xì)胞核，在食管癌腫瘤細(xì)胞上以低表達(dá)為主，在正常的食管上皮細(xì)胞上以高表達(dá)為主。B7-H1主要表達(dá)在食管癌細(xì)胞的胞漿及胞膜，在食管

5、癌腫瘤細(xì)胞中以高表達(dá)為主，而在正常的食管上皮細(xì)胞以低表達(dá)或不表達(dá)為主。男性患者IFIT2染色H-score≥50的比率顯著高于女性患者(x2=9.349，P=0.002);IFIT2染色強(qiáng)度與年齡、T、N、M、TNM分期、腫瘤大小等預(yù)后相關(guān)因素的關(guān)系差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Log-rank生存分析顯示IFIT2高表達(dá)組[57.16(50.83～63.50)]比低表達(dá)組[41.58(31.36～51.80)]平均術(shù)后生存時(shí)間顯

6、著延長15.58個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=6.531，P=0.011)。食管癌組織多因素COX模型分析顯示，IFIT2是食管癌獨(dú)立的正性預(yù)后因素(HR=0.41，95％CI=0.19～0.88，P=0.023)。以B7-H1的H-score=140為Cut-off值，H-score＞140定為高表達(dá)，H-score≤140定為低表達(dá);以IFIT2的H-score=25為Cut-off值，IFIT2的H-score＞25定為高表達(dá)，H

7、-score≤25定為低表達(dá)。食管癌組織B7-H1與IFIT2表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.203，P=0.044)。
　　(2)我們通過基因干擾技術(shù)構(gòu)建食管癌細(xì)胞Eca-109中B7-H1表達(dá)下調(diào)的模型，流式細(xì)胞術(shù)及qRT-PCR驗(yàn)證穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LV-B7-H1-shRNA的Eca-109細(xì)胞株中B7-H1表達(dá)水平顯著低于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LV-Scramble的Eca-109細(xì)胞株。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)分析顯示LV-B7-H1-sh

8、RNA的Eca-109細(xì)胞(2.66±0.34)中IFIT2啟動子活性顯著高于LV-Scramble的Eca-109細(xì)胞(1.00±0.19)(P＜0.001)。我們通過基因過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建技術(shù)構(gòu)建食管癌細(xì)胞Eca-109中B7-H1表達(dá)上調(diào)的模型，流式細(xì)胞術(shù)及qRT-PCR驗(yàn)證穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LV-B7-H1的Eca-109細(xì)胞株中B7-H1表達(dá)水平顯著高于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LV-NC的Eca-109細(xì)胞株。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)分析顯示LV-

9、B7-H1的Eca-109細(xì)胞(0.43±0.10)中IFIT2啟動子活性顯著低于LV-NC的Eca-109細(xì)胞（1.00±0.18）(P＜0.01)。
　　(3)食管癌細(xì)胞LV-B7-H1-shRNA細(xì)胞中STAT1水平顯著高于LV-Scramble細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，LV-B7-H1細(xì)胞中STAT1水平與LV-NC細(xì)胞差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。LV-B7-H1-shRNA細(xì)胞中phos-STAT1

10、-y701磷酸化水平顯著高于LV-Scramble細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，LV-B7-H1細(xì)胞中phos-STAT1-y701磷酸化水平顯著低于LV-NC細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。LV-B7-H1-shRNA細(xì)胞中IFIT2水平顯著高于LV-Scramble細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，LV-B7-H1細(xì)胞中IFIT2水平顯著低于LV-NC細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。LV-B7

11、-H1-shRNA細(xì)胞中IFIT2 mRNA水平顯著高于LV-Scramble細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，選取JAK抑制劑AG490處理LV-Scramble及LV-B7-H1-shRNA的Eca-109細(xì)胞后，LV-B7-H1-shRNA細(xì)胞中IFIT2 mRNA升高趨勢被抑制，其他JAK抑制劑AZD1480，CP-690550、CYT387處理細(xì)胞后，LV-B7-H1-shRNA細(xì)胞中IFIT2mRNA較未處理組差異無統(tǒng)

12、計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。LV-Scramble轉(zhuǎn)染LV-Scramble及LV-B7-H1-shRNA的Eca-109細(xì)胞后LV-B7-H1-shRNA的Eca-109細(xì)胞中的IFIT2mRNA表達(dá)水平顯著高于LV-Scramble(P＜0.001);LV-STAT1-shRNA轉(zhuǎn)染LV-Scramble及LV-B7-H1-shRNA的Eca-109細(xì)胞后LV-B7-H1-shRNA的Eca-109細(xì)胞中的IFIT2mRNA表達(dá)水平顯

13、著高于LV-Scramble(P＜0.01);LV-STAT1-shRNA轉(zhuǎn)染的LV-B7-H1-shRNA的Eca-109細(xì)胞中的IFIT2 mRNA表達(dá)水平顯著低于LV-Scramble轉(zhuǎn)染的LV-B7-H1-shRNA的Eca-109細(xì)胞(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　IFIT2在食管癌中低表達(dá)，對食管癌的預(yù)后判斷具有潛在價(jià)值。在食管癌組織中IFIT2與B7-H1表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。B7-H1對IFIT2的啟動子活性