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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
食管癌是發(fā)生在食管粘膜上皮的惡性腫瘤,是世界第七大惡性腫瘤。我國(guó)是世界上食管癌發(fā)生率和重中之重重中之重病死率最高的國(guó)家之一,嚴(yán)重困擾著國(guó)民的身心健康,所以,尋找食管癌的特異性生物標(biāo)記物,用于早期診斷和靶向治療成為研究食管癌的熱點(diǎn)。腫瘤免疫療法是繼手術(shù)、放化療后第四大有效的抗腫瘤療法,免疫療法基于腫瘤特異性抗原和免疫細(xì)胞。近年來(lái),共刺激分子B7-H3作為B7免疫球蛋白超家族的新成員,在多種腫瘤組織異常高表達(dá),并與腫瘤的生
2、物學(xué)特性密切相關(guān),被認(rèn)為可能是一種新的腫瘤標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)。腫瘤微環(huán)境中大量存在的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages,TAM)在腫瘤的發(fā)生、生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中扮演著十分重要的角色。腫瘤特定微環(huán)境迫使巨噬細(xì)胞表型向著有利于腫瘤發(fā)展的方向演變,即M2型TAM,其在腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中的重要作用,已成為抗腫瘤治療的新熱點(diǎn)。本課題旨在通過(guò)檢測(cè)食管癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織中B7-H3、CD68和CD1
3、63蛋白的表達(dá),分析B7-H3表達(dá)、M2型TAM浸潤(rùn)與食管癌臨床病理資料的相關(guān)性。檢測(cè)不同食管癌細(xì)胞株Eca-109、TE-1、TE-13、KYSE-170細(xì)胞中B7-H3的表達(dá)水平,并通過(guò)靶向干擾B7-H3基因表達(dá)來(lái)研究Eca-109細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響。
方法:
1、用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time reverse transcription-polymerasechain reaction,Real
4、-time PCR)方法檢測(cè)HLA-DRa和CD163 mRNA在食管癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)水平;
2、用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)B7-H3、 CD68和CD163蛋白在食管癌組織中的表達(dá)水平,并分析其表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系;
3、用Real-time PCR和Western blot方法檢測(cè)食管癌細(xì)胞株Eca-109、TE-1、TE-13、KYSE-170中B7-H3 mRNA和蛋白表達(dá)情況;
5、4、用Real-time PCR和Western blot方法檢測(cè)上調(diào)和下調(diào)B7-H3基因后,Eca-109細(xì)胞中B7-H3 mRNA和蛋白表達(dá)情況;
5、用Real-time PCR方法檢測(cè)上調(diào)和下調(diào)B7-H3基因的Eca-109細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后,巨噬細(xì)胞中HLA-DRa和CD163 mRNA表達(dá)情況;
6、用流式細(xì)胞分析技術(shù)(flow cytometry,F(xiàn)CM)檢測(cè)上調(diào)和下調(diào)B7-H3基因的Eca-109
6、細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后,巨噬細(xì)胞表面HLA-DR、CD86、CD163和CD206蛋白的表達(dá)情況;
7、用ELISA方法檢測(cè)上調(diào)和下調(diào)B7-H3基因后,Eca-109細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6和M-CSF的分泌量;
8、用Western blot方法檢測(cè)上調(diào)和下調(diào)B7-H3基因的Eca-109細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后,巨噬細(xì)胞表面P-STAT3、STAT3和P-P65、P65蛋白表達(dá)情況;
9、用Real-tim
7、e PCR方法檢測(cè)巨噬細(xì)胞中分別加入STAT3通路抑制劑AG490和NF-κB通路抑制劑PDTC后,再分別與上調(diào)和下調(diào)B7-H3基因的Eca-109細(xì)胞共培養(yǎng),巨噬細(xì)胞中HLA-DRa和CD163 mRNA表達(dá)情況;
10、用FCM檢測(cè)巨噬細(xì)胞中分別加入STAT3通路抑制劑AG490和NF-κB通路抑制劑PDTC后,再分別與上調(diào)和下調(diào)B7-H3基因的Eca-109細(xì)胞共培養(yǎng),巨噬細(xì)胞表面HLA-DR、CD86、CD163和CD
8、206蛋白的表達(dá)情況。
結(jié)果:
1、Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,30例食管癌組織中HLA-DRa(2.128±0.127)和CD163(5.696±0.136) mRNA的表達(dá)水平顯著高于對(duì)應(yīng)癌旁組織(1.000±0.000),差異具有顯著性意義(P<0.01),食管癌組織中CD163 mRNA的表達(dá)水平顯著高于HLA-DRa,差異具有顯著性意義(P<0.001)。
2、免疫組織化學(xué)分析結(jié)果顯示
9、,70例食管癌組織中,B7-H3蛋白主要定位在腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)和胞膜,陽(yáng)性表達(dá)率為98.6%(69/70),明顯高于對(duì)應(yīng)癌旁組織的7.1%(5/70),x2=117.41,P<0.001; CD68和CD163蛋白大部分聚集在癌間質(zhì)巨噬細(xì)胞的胞質(zhì)和胞膜,呈灶狀或片狀分布。CD68陽(yáng)性表達(dá)率為91.4%(64/70),明顯高于對(duì)應(yīng)癌旁組織的18.6%(13/70),x2=75.07,P<0.001;而CD163陽(yáng)性表達(dá)率為84.3%(59/7
10、0),對(duì)應(yīng)癌旁組織中幾乎不表達(dá)。B7-H3表達(dá)與患者腫瘤浸潤(rùn)深度相關(guān),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CD68表達(dá)與患者腫瘤浸潤(rùn)深度相關(guān),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CD163表達(dá)與患者腫瘤大小及腫瘤浸潤(rùn)深度相關(guān),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
3、Spearman相關(guān)性分析顯示,70例食管癌組織中B7-H3蛋白表達(dá)水平與CD68表達(dá)呈正相關(guān)(R=0.300,P<0.05),與CD163表達(dá)也呈正相關(guān)(R=0
11、.288,P<0.05)。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示,食管癌組織中B7-H3、CD68和CD163蛋白呈高表達(dá)者總體生存率明顯低于低表達(dá)者,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
4、Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,B7-H3 mRNA在食管癌Eca-109(0.449±0.037)、TE-1(0.488±0.027)、TE-13(1.000±0.000)和KYSE-170(0.297±0.016)細(xì)胞中均
12、表達(dá),在TE-13中的表達(dá)量最高。Western blot結(jié)果顯示,B7-H3蛋白在TE-1(0.865±0.023)中呈中表達(dá),在KYSE-170(0.443±0.018)中呈低表達(dá),而在Eca-109(1.129±0.010)和TE-13(1.146±0.017)中呈高表達(dá),且兩者間的表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
5、Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,Eca-109/B7-H3中B7-H3 mRNA表達(dá)水
13、平明顯高于Eca-109/control[(1.624±0.055) vs(0.932±0.037),P<0.01]及Eca-109組[(1.624±0.055)vs(1.000±0.000), P<0.01];Eca-109/B7-H3 siRNA中B7-H3 mRNA表達(dá)水平明顯低于Eca-109/controlsiRNA[(0.295±0.067) vs(0.929±0.037), P<0.01]及Eca-109組[(0.295±
14、0.067) vs(1.000±0.000),P<0.01]。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,Eca-109/B7-H3中B7-H3蛋白表達(dá)水平明顯高于Eca-109/control[(0.164±0.007) vs(0.092±0.002), P<0.001]及Eca-109組[(0.164±0.007)vs(0.091±0.001),P<0.001],Eca-109/B7-H3 siRNA中B7-H3蛋白表達(dá)水平明顯低于Eca
15、-109/control siRNA[(0.028±0.001) vs(0.091±0.001),P<0.001]及Eca-109組[(0.028±0.001) vs(0.091±0.001),P<0.001]。
6、Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,與單獨(dú)培養(yǎng)巨噬細(xì)胞相比,Eca-109細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)48h后,巨噬細(xì)胞中CD163 mRNA表達(dá)增加[(1.645±0.062) vs(1.000±0.000), P
16、<0.001],HLA-DRa mRNA表達(dá)降低[(0.865±0.065) vs(1.000±0.000),P<0.05],說(shuō)明Eca-109細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化。Eca-109/B7-H3與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)48h后,巨噬細(xì)胞中CD163 mRNA表達(dá)水平明顯高于正常共培養(yǎng)體系[(2.606±0.128)vs(1.645±0.062),P<0.001],HLA-DRa mRNA表達(dá)水平明顯低于正常共培養(yǎng)體系[(
17、0.537±0.083) vs(0.865±0.065),P<0.01],說(shuō)明Eca-109/B7-H3能夠促使巨噬細(xì)胞向M2型極化。而Eca-109/B7-H3 siRNA與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)48h后,巨噬細(xì)胞中HLA-DRamRNA表達(dá)水平明顯高于正常共培養(yǎng)體系[(1.753±0.073) vs(0.865±0.065),P<0.001],CD163 mRNA表達(dá)水平明顯低于正常共培養(yǎng)體系[(0.544±0.049) vs(1.645±
18、0.062), P<0.001],說(shuō)明Eca-109/B7-H3siRNA能夠逆轉(zhuǎn)巨噬細(xì)胞向M1型極化。
7、FCM檢測(cè)結(jié)果顯示,與單獨(dú)培養(yǎng)巨噬細(xì)胞相比,Eca-109細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)48h后,巨噬細(xì)胞表面CD163[(36.400±1.353) vs(23.367±1.201), P<0.001]和CD206[(26.367±1.210) vs(23.733±0.971),P<0.05]蛋白表達(dá)增加,HLA-DR[(20
19、.333±0.833) vs(23.400±0.755),P<0.01]和CD86[(18.500±0.557) vs(21.633±0.833), P<0.01]蛋白表達(dá)降低,說(shuō)明Eca-109細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化。Eca-109/B7-H3與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)48h后,巨噬細(xì)胞表面CD163[(630.333±1.528) vs(36.400±1.353), P<0.001]和CD206[(36.200±1.1
20、14) vs(26.367±1.210),P<0.001]蛋白表達(dá)水平明顯高于正常共培養(yǎng)體系,HLA-DR[(11.167±0.850) vs(20.333±0.833),P<0.001]和CD86[(10.867±0.611)vs(18.500±0.557),P<0.001]蛋白表達(dá)水平明顯低于正常共培養(yǎng)體系,說(shuō)明Eca-109/B7-H3能夠促使巨噬細(xì)胞向M2型極化。而Eca-109/B7-H3 siRNA與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)48h后,
21、巨噬細(xì)胞表面HLA-DR[(241.667±1.528)vs(20.333±0.833),P<0.001]和CD86[(64.567±0.850) vs(18.500±0.557),P<0.001]蛋白表達(dá)水平明顯高于正常共培養(yǎng)體系,CD163[(17.467±0.907) vs(36.400±1.353),P<0.01]和CD206[(13.533±1.069) vs(26.367±1.210), P<0.001]蛋白表達(dá)水平明顯低于
22、正常共培養(yǎng)體系,說(shuō)明Eca-109/B7-H3 siRNA能夠逆轉(zhuǎn)巨噬細(xì)胞向M1型極化。
8、ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,Eca-109/B7-H3培養(yǎng)上清中IL-6[(38.713±1.991pg/ml) vs(26.267±1.560 pg/ml), P<0.01]和M-CSF[(85.380±6.052 pg/ml)vs(59.600±4.733 pg/ml),P<0.01]的分泌量明顯高于Eca-109細(xì)胞分泌量,差異具有
23、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而Eca-109/B7-H3 siRNA培養(yǎng)上清中IL-6[(15.033±1.427 pg/ml) vs(26.267±1.560 pg/ml), P<0.001]和M-CSF[(28.367±4.747 pg/ml) vs(59.600±4.733 pg/ml), P<0.01]的分泌量明顯低于Eca-109細(xì)胞分泌量。
9、Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,Eca-109/B7-H3與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)48h
24、后,巨噬細(xì)胞表面P-STAT3[(0.219±0.010) vs(0.097±0.008),P<0.001]和STAT3[(1.539±0.026) vs(1.876±0.012),P<0.001]蛋白表達(dá)水平明顯高于正常共培養(yǎng)體系;而Eca-109/B7-H3 siRNA與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)48h后,巨噬細(xì)胞表面P-P65[(0.257±0.007)vs(0.173±0.002),P<0.001]和P65[(0.347±0.007) vs
25、(0.292±0.009),P<0.01]蛋白表達(dá)水平明顯高于正常共培養(yǎng)體系。
10、Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,巨噬細(xì)胞中加入STAT3信號(hào)通路抑制劑AG490后與Eca-109/B7-H3共培養(yǎng)48h,巨噬細(xì)胞中CD163 mRNA表達(dá)水平明顯低于未加抑制劑組[(1.918±0.088) vs(2.606±0.128),P<0.01],HLA-DRa mRNA表達(dá)水平略高于未加抑制劑組[(0.624±0.079
26、)vs(0.537±0.083),P>0.05],說(shuō)明巨噬細(xì)胞中加入STAT3通路抑制劑AG490后,能抑制Eca-109/B7-H3促使巨噬細(xì)胞M2型極化的作用。而巨噬細(xì)胞中加入NF-κB通路抑制劑PDTC后與Eca-109/B7-H3 siRNA共培養(yǎng)48h,巨噬細(xì)胞中HLA-DRa mRNA表達(dá)水平明顯低于未加抑制劑組[(1.310±0.056) vs(1.753±0.073),P<0.01],CD163mRNA表達(dá)水平明顯高于未
27、加抑制劑組[(1.185±0.134) vs(0.544±0.049),P<0.01],說(shuō)明巨噬細(xì)胞中加入NF-κB通路抑制劑PDTC后,能抑制Eca-109/B7-H3siRNA促使巨噬細(xì)胞M1型極化的作用。
11、FCM檢測(cè)結(jié)果顯示,巨噬細(xì)胞中加入STAT3信號(hào)通路抑制劑AG490后與Eca-109/B7-H3共培養(yǎng)48h,巨噬細(xì)胞表面CD163[(70.367±0.862) vs(159.333±2.517), P<0.
28、001]和CD206[(60.967±1.301)vs(149.667±2.082),P<0.001]蛋白表達(dá)水平明顯低于未加抑制劑組,HLA-DR[(60.433±1.026)vs(29.500±0.985),P<0.001]和CD86[(24.767±0.551)vs(11.867±0.651),P<0.001]蛋白表達(dá)水平明顯高于未加抑制劑組,說(shuō)明巨噬細(xì)胞中加入STAT3通路抑制劑AG490后,能抑制Eca-109/B7-H3促使
29、巨噬細(xì)胞M2型極化的作用。而巨噬細(xì)胞中加入NF-κB通路抑制劑PDTC后與Eca-109/B7-H3 siRNA共培養(yǎng)48h,巨噬細(xì)胞表面HLA-DR[(140.333±1.528) vs(238.667±3.512),P<0.001]和CD86[(30.567±0.709) vs(49.433±0.709),P<0.001]蛋白表達(dá)水平明顯低于未加抑制劑組,CD163[(31.700±0.755)vs(12.700±0.819),P<
30、0.001]和CD206[(25.500±0.656) vs(13.100±0.557),P<0.001]蛋白表達(dá)水平明顯高于未加抑制劑組,說(shuō)明巨噬細(xì)胞中加入NF-κB通路抑制劑PDTC后,能抑制Eca-109/B7-H3 siRNA促使巨噬細(xì)胞M1型極化的作用。
結(jié)論:
1、共刺激分子B7-H3和M2型TAM標(biāo)記物CD68、CD163蛋白在人食管癌組織中高表達(dá),且與食管癌患者的進(jìn)展及預(yù)后密切相關(guān),有望成為監(jiān)測(cè)食管癌
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