共刺激分子B7-H3在肝細(xì)胞癌的表達(dá)及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、研究目的:闡明肝細(xì)胞癌組織表達(dá)共刺激分子B7-H3的特點(diǎn)及與患者臨床特征、預(yù)后的關(guān)系，探討B(tài)7-H3分子對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.通過(guò)免疫組化檢測(cè)116例肝癌患者組織B7-H3的表達(dá)水平和特點(diǎn)，并比較不同分組間B7-H3的表達(dá)差異。通過(guò)Kaplan-Meier生存分析比較不同B7-H3表達(dá)水平患者總體預(yù)后的差異并采用Cox風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行預(yù)后因素分析。
　　2.構(gòu)建B7-H3-shRNA

2、沉默質(zhì)粒，下調(diào)肝癌細(xì)胞系HepG2和SMMC7721的B7-H3基因表達(dá)，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)和ELISA凋亡試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖能力和凋亡水平變化，通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞平面運(yùn)動(dòng)能力變化，通過(guò)transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響。
　　3.通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默B7-H3基因后侵襲相關(guān)分子MMP-2、MMP-9，EMT相關(guān)分子E-cadherin、Vimentin、N-cadherin，以及JAK/Stat信號(hào)

3、通路分子p-stat3、p-JAK2和EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Slug和Snail的表達(dá)變化。
　　4.通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)CD68陽(yáng)性腫瘤浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞在116例肝癌患者組織中的分布及特點(diǎn)，分析TAMs浸潤(rùn)數(shù)量與B7-H3表達(dá)的相關(guān)性，以及TAMs數(shù)量與預(yù)后的關(guān)系。
　　5.分別將HepG2細(xì)胞與PMA誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞采用接觸共育和非接觸共育培養(yǎng)，通過(guò)RT-PCR和western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)M1型巨噬細(xì)胞特征性分子H

4、LA-DR、iNOS和TNF-α，以及M2型分子Arg1、VEGF和CCL22的表達(dá)。
　　6.在接觸共育培養(yǎng)體系中，采用B7-H3-shRNA沉默質(zhì)粒下調(diào)HepG2細(xì)胞B7-H3基因表達(dá)，通過(guò)RT-PCR和western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)M1型分子HLA-DR、iNOS和TNF-α，M2型分子Arg1、VEGF和CCL22的表達(dá)。并進(jìn)一步通過(guò)加入外源重組B7-H3蛋白，觀察是否可逆轉(zhuǎn)沉默B7-H3對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響。
　

5、　研究結(jié)果:
　　1.116例肝癌組織標(biāo)本中，109例可檢測(cè)到強(qiáng)弱不等的B7-H3表達(dá)。B7-H3的表達(dá)水平在不同TNM分期及按是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組，組間有顯著性差異。生存分析提示B7-H3低表達(dá)組有更高的生存率，B7-H3高表達(dá)提示預(yù)后不良。
　　2.采用B7-H3-shRNA沉默質(zhì)粒下調(diào)HepG2和SMMC7721細(xì)胞B7-H3基因表達(dá)后:1）細(xì)胞增殖和凋亡水平無(wú)明顯變化;2）平面移行能力和侵襲能力顯著下降;3）EMT

6、機(jī)制受到抑制，表現(xiàn)為E-鈣粘蛋白表達(dá)升高，而波形蛋白、N-鈣粘蛋白表達(dá)下降;4）MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平和活性下降;5）p-star3和p-JAK2及EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Slug的表達(dá)下調(diào)。
　　3.116例肝癌組織標(biāo)本中，94.8％可檢測(cè)到以CD68為標(biāo)志的TAMs浸潤(rùn)，顯著高于癌旁和正常肝組織，且浸潤(rùn)水平與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。B7-H3的表達(dá)水平和TAMs的浸潤(rùn)數(shù)量呈顯著正相關(guān)。
　　6.采用非接

7、觸共育培養(yǎng)和接觸共育培養(yǎng)，HepG2細(xì)胞均可誘導(dǎo)THP-1來(lái)源的巨噬細(xì)胞發(fā)生M2亞型極化，表現(xiàn)為HLA-DR、iNOS和TNF-α表達(dá)下降，而Arg1、VEGF和CCL22表達(dá)升高，其中接觸共育的誘導(dǎo)作用更為明顯。
　　7.采用B7-H3-shRNA沉默質(zhì)粒下調(diào)B7-H3基因表達(dá)可抑制HepG2細(xì)胞誘導(dǎo)THP-1來(lái)源的巨噬細(xì)胞發(fā)生M2亞型極化，而加入外源重組B7-H3蛋白可一定程度逆轉(zhuǎn)siRNA的沉默作用。
　　結(jié)論:

8、>　　1.B7-H3在肝癌組織表達(dá)明顯升高，且與腫瘤分期、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。
　　2.B7-H3的表達(dá)增強(qiáng)了肝癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力。
　　3.B7-H3對(duì)肝癌的侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響與通過(guò)JAK-2/Stat-3/Slug通路介導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化機(jī)制有關(guān)。
　　4.肝癌組織腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)水平與疾病進(jìn)程和預(yù)后密切相關(guān)，且與組織B7-H3的表達(dá)呈顯著正相關(guān)。
　　5.肝癌細(xì)胞可通過(guò)B7-H3誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞