新型共刺激分子B7-H3在胰腺癌惡性進(jìn)展中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分 B7-H3分子在胰腺癌中的表達(dá)及其臨床意義
　　目的：研究胰腺癌組織中共刺激分子B7同源性3（B7-H3）的表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系。
　　方法：應(yīng)用HE染色、酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)（ELISA）試劑盒及免疫組化(IHC)S-P法檢測42例臨床切除的胰腺癌標(biāo)本中B7-H3的表達(dá)水平，分析其與腫瘤臨床病理特征之間的關(guān)系。
　　結(jié)果：ELISA方法檢測組織抽提液結(jié)果顯示，胰腺癌和正常胰腺中B7-H3的表達(dá)水平依次為

2、168.31±88.59ng/g、64.03±33.75ng/g，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.106， P＜0.001)。免疫組化檢測結(jié)果顯示 B7-H3在胰腺癌組織中的表達(dá)明顯高于正常胰腺組織（χ2=34.968，P=0.000），B7-H3的陽性表達(dá)與腫瘤的 TNM分期、局部浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。
　　結(jié)論：胰腺癌患者腫瘤組織中B7-H3呈過量表達(dá)，且腫瘤組織中B7-H3的陽性表達(dá)與腫瘤的TNM分期、局部浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等

3、惡性進(jìn)展指標(biāo)呈顯著正相關(guān)。
　　第二部分特異性B7-H3基因的RNA干擾有效靶點(diǎn)序列的設(shè)計與篩選
　　目的：構(gòu)建靶向B7-H3的shRNA質(zhì)粒載體，篩選出干擾效率最佳的RNAi靶點(diǎn)。
　　方法：根據(jù)B7-H3基因的DNA序列設(shè)計4個RNA干擾靶點(diǎn)，分別根據(jù)靶點(diǎn)序列合成4條小發(fā)卡RNA（shRNA），再分別構(gòu)建4個shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體，并行PCR和測序鑒定。經(jīng)鑒定正確后分別與過表達(dá)B7-H3的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，通

4、過Western blot檢測FLAG基因表達(dá)篩選RNA干擾有效靶點(diǎn)。
　　結(jié)果：構(gòu)建的shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體經(jīng)PCR及DNA測序鑒定表明質(zhì)粒載體構(gòu)建成功。特異性B7-H3基因的shRNA可抑制轉(zhuǎn)染了過表達(dá)質(zhì)粒的293T細(xì)胞的B7-H3基因的表達(dá)，其中以B7-H3-shRNA-4號序列的抑制作用最為顯著。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建了特異性 B7-H3基因的shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體并篩選出了最佳RNA干擾序列。
　　第三部分穩(wěn)定

5、低表達(dá)B7-H3的胰腺癌細(xì)胞株的建立
　　目的：構(gòu)建靶向B7-H3的shRNA慢病毒（Lentivirus，LV）載體，并轉(zhuǎn)染人胰腺癌細(xì)胞系Patu8988，建立穩(wěn)定低表達(dá)B7-H3的Patu8988細(xì)胞株。
　　方法：pGCSIL-GFP-B7-H3-shRNA4質(zhì)粒，pHelper1.0質(zhì)粒，pHelper2.0質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，進(jìn)行病毒包裝，構(gòu)建慢病毒載體LV-B7-H3-shRNA。測定滴度后轉(zhuǎn)染Patu898

6、8細(xì)胞，流式細(xì)胞儀（FCM）分選陽性細(xì)胞并檢測轉(zhuǎn)染效率，Real-time PCR、Western blot及流式細(xì)胞儀檢測B7-H3基因的敲減效率。
　　結(jié)果：靶向B7-H3的shRNA慢病毒載體LV-B7-H3-shRNA構(gòu)建成功，病毒滴度為3x109 TU/ml。Sorting FCM分選后，轉(zhuǎn)染效率已達(dá)90％以上且穩(wěn)定表達(dá)，Real-time PCR和FCM檢測B7-H3在mRNA水平和蛋白水平的抑制率分別是97.8%及8

7、3.4%。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建了 LV-B7-H3-shRNA病毒載體，成功建立了穩(wěn)定低表達(dá) B7-H3的B7-H3low/Patu8988細(xì)胞株。
　　第四部分 B7-H3在胰腺癌增殖及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制
　　目的：通過體外、體內(nèi)實(shí)驗研究B7-H3分子表達(dá)下降對胰腺癌Patu8988細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，探討B(tài)7-H3分子在胰腺癌增殖及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制。
　　方法：實(shí)驗分3組：空白對照組(Patu

8、8988組)，陰性對照組(B7-H3+NC/Patu8988組)，實(shí)驗組(B7-H3low/Patu8988組)。MTT法檢測細(xì)胞增殖能力，細(xì)胞-基質(zhì)粘附實(shí)驗檢測細(xì)胞粘附能力，劃痕實(shí)驗檢測細(xì)胞水平遷移能力，Transwell侵襲實(shí)驗檢測細(xì)胞侵襲能力。3組細(xì)胞分別建立人胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型和原位模型。在皮下移植瘤模型實(shí)驗中，觀察抑瘤效果，HE染色證實(shí)為胰腺癌皮下移植瘤，免疫組化法檢測B7-H3表達(dá)。在原位模型實(shí)驗中，觀察抑瘤效果并計算

9、腹腔內(nèi)原位移植瘤及轉(zhuǎn)移瘤腫瘤重量。
　　結(jié)果：生長率測定結(jié)果顯示，3組細(xì)胞在0、24、48、72h時間點(diǎn)MTT實(shí)驗所得OD值差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.191, P=0.831; F=0.327, P=0.733; F=982, P=0.428;F=412, P=0.680）。細(xì)胞-基質(zhì)粘附實(shí)驗結(jié)果顯示，實(shí)驗組對FN的粘附能力較空白對照組及陰性對照組明顯下降。差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<0.05），而空白對照組和陰性對照組之間差異無

10、統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。體外劃痕實(shí)驗結(jié)果顯示，劃痕后6、12、18、24 h各時間點(diǎn)實(shí)驗組相對寬度均大于空白對照組及陰性對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<0.05），而后兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均>0.05）。Transwell實(shí)驗結(jié)果顯示，實(shí)驗組侵襲過膜細(xì)胞數(shù)少于空白對照組及陰性對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<0.05），而后兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。裸鼠皮下移植瘤模型的實(shí)驗結(jié)果顯示，3組均建模成功，實(shí)驗組皮下移

11、植瘤的體積增長明顯滯后于陰性對照組和空白對照組。實(shí)驗結(jié)束時，實(shí)驗組的腫瘤體積（61.67±8.91 mm3）比空白對照組（227.67±56.35 mm3）和陰性對照組（211.67±52.75 mm3）明顯減小，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.0001)。皮下移植瘤免疫組化實(shí)驗顯示，實(shí)驗組B7-H3表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)少于空白對照組及陰性對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<0.001），而后兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.93）。裸鼠胰腺癌原位

12、移植瘤模型實(shí)驗結(jié)果顯示，實(shí)驗組原位移植瘤+腹腔轉(zhuǎn)移瘤的重量小于空白對照組及陰性對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<0.001），而后兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.825）。
　　結(jié)論：在體外，B7-H3分子能夠促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞粘附、水平遷移及侵襲轉(zhuǎn)移，但不影響細(xì)胞生長曲線。在體內(nèi)，B7-H3分子能夠促進(jìn)胰腺癌腫瘤生長，局部浸潤和遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移。
　　第五部分 B7-H3在胰腺癌抵抗吉西他濱化療中的作用機(jī)制
　　目的：通過體

13、外、體內(nèi)實(shí)驗研究胰腺癌細(xì)胞中B7-H3表達(dá)下降對其抵抗吉西他濱化療的影響，探討B(tài)7-H3分子在胰腺癌抵抗吉西他濱化療中的作用機(jī)制。
　　方法：體外實(shí)驗分3組：空白對照組(Patu8988組)，陰性對照組(B7-H3+NC/Patu8988組)，實(shí)驗組(B7-H3low/Patu8988組)。MTT法檢測在不同吉西他濱藥物濃度下，胰腺癌Patu8988細(xì)胞B7-H3表達(dá)下降對其化療敏感性的影響。PI實(shí)驗檢測在一定吉西他濱藥物濃度下，

14、胰腺癌Patu8988細(xì)胞B7-H3表達(dá)下降對細(xì)胞凋亡的影響。單色標(biāo)記全基因組芯片篩選在一定吉西他濱藥物濃度下，胰腺癌Patu8988細(xì)胞B7-H3表達(dá)下降對細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響。Western blot檢測B7-H3表達(dá)下降對細(xì)胞抗凋亡分子 survivin表達(dá)的影響。在體內(nèi)實(shí)驗中，Patu8988組，B7-H3+NC/Patu8988組，B7-H3low/Patu8988組3組細(xì)胞分別建立人胰腺癌SCID小鼠皮下移植瘤模型，每

15、組再根據(jù)是否接受吉西他濱化療分為2個亞組。在動物模型實(shí)驗中，觀察抑瘤效果， HE染色證實(shí)為胰腺癌皮下移植瘤，TUNEL檢測吉西他濱化療各組胰腺癌皮下移植瘤的凋亡情況，免疫組化法檢測吉西他濱化療各組胰腺癌皮下移植瘤survivin表達(dá)水平。
　　目的：探討自噬在SLE發(fā)病中的作用。結(jié)果體外實(shí)驗中，吉西他濱化療敏感性實(shí)驗結(jié)果顯示，在0.50、1.00、2.50、5.00μmol/L等不同的吉西他濱藥物濃度下，3組細(xì)胞的生長抑制率差異均

16、有統(tǒng)計學(xué)意義（F=9.561, P=0.014;F=10.86, P=0.010;F=6.286, P=0.034;F=25.87, P=0.0011）。在4種不同的吉西他濱藥物濃度下B7-H3low/Patu8988組生長抑制率與Patu8988組及B7-H3+NC/Patu8988組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<0.05），而后兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均>0.05）。PI檢測凋亡的實(shí)驗結(jié)果顯示，3組細(xì)胞經(jīng)5.00μmol/L的吉

17、西他濱處理48h后，B7-H3low/Patu8988組細(xì)胞凋亡率與Patu8988組及B7-H3+NC/Patu8988組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<0.001），而后兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.959）。抽提RNA經(jīng)質(zhì)檢合格后，全基因組基因芯片檢測結(jié)果顯示，B7-H3low/Patu8988組survivin基因在mRNA水平的表達(dá)比B7-H3low/Patu8988組明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=15.80，P<0.0001）

18、。Western blot實(shí)驗證實(shí)了基因芯片的結(jié)論。在SCID小鼠皮下移植瘤模型體內(nèi)實(shí)驗中，吉西他濱在低表達(dá)B7-H3的B7-H3low/Patu8988細(xì)胞成瘤組顯示更強(qiáng)的抑瘤作用。相同吉西他濱治療方案的B7-H3low/Patu8988+GCB組腫瘤體積（69.00±7.71 mm3）比Patu8988+GCB組（290.00±36.88 mm3）和B7-H3+NC/Patu8988+GCB組（285.80±40.89mm3）明顯減

19、小，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=77.515， P<0.0001)。而后兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.840）。TUNEL檢測凋亡的實(shí)驗結(jié)果顯示， B7-H3low/Patu8988+GCB組皮下移植瘤的凋亡指數(shù)高于Patu8988+GCB組及B7-H3+NC/Patu8988+GCB組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<0.0001），而后兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.97）。免疫組化實(shí)驗顯示，行吉西他濱化療的各組SCID小鼠皮下移植瘤中sur