腺相關病毒介導的PD-L1基因轉(zhuǎn)染對大鼠移植肝的保護作用及其機制.pdf

1、研究背景： 器官移植后器官功能維持的主要障礙是術(shù)后排斥反應和免疫抑制劑的毒性?；蛑委煘楦我浦差I域供肝抵抗移植后排斥反應和損傷提供了新的治療思路。將免疫調(diào)節(jié)基因?qū)胍浦哺蝺?nèi)，使其表達致耐受分子，產(chǎn)生能抑制受體免疫反應的細胞因子，可有效地抑制排斥反應的發(fā)生和增強移植肝的保護功能，能在不用或少量使用免疫抑制劑的情況下延長移植肝存活，甚至長期存活。 程序性死亡配體-1(Programmed Death Ligand-1，PD-

2、L1)是一種重要的抑制性共刺激分子，可通過激活初始T細胞、抑制活化的效應T細胞及調(diào)節(jié)細胞因子的分泌等參與多種免疫過程。體外研究發(fā)現(xiàn)：PD-L1與其受體程序性死亡-1(Programmed Death-1，PD-1)結(jié)合后，能抑制活化T細胞增殖及細胞因子的產(chǎn)生。動物實驗也證實，在心臟、胰島、角膜、皮膚等多種器官移植模型中，PD-L1均能抑制排斥反應及延長移植物的存活；這強烈提示了PD-L1可能具有保護移植肝免受排斥反應損傷的治療潛能。PD

3、-L1可通過多種機制產(chǎn)生免疫抑制效應，與肝移植聯(lián)系起來考慮，它可能通過抑制活化T細胞的增殖及細胞因子的合成、分泌，從而阻斷宿主對移植肝的攻擊。此外，免疫抑制分子的局部表達有可能減少其全身性副作用、增加其生物利用度及治療效應，因此是減輕排斥反應、促進移植物長期存活的很有前景的方法。腺相關病毒(Adeno-associated Virus，AAv)是移植物保護分子轉(zhuǎn)染和表達的理想載體。報告基因紅色熒光蛋白(Red Fluorescent P

4、rotein，RFP)因其具有靈敏度高、信號清楚等特點亦日益受到關注。 研究目的： 基于以上分析，本研究擬通過建立近交系大鼠原位肝移植模型，以RFP為報告基因，將AAV作為PD-L1的載體，采用冷保存期門靜脈灌注夾閉法轉(zhuǎn)染供肝，觀察其安全性和有效性。在此基礎上，于活體內(nèi)觀察PD-L1基因轉(zhuǎn)染對大鼠異基因肝移植術(shù)后肝臟的保護作用及其與亞劑量CsA的協(xié)同效果，并通過檢測PD-L1對移植肝CD4+、CD8+、CD25+淋巴細胞

5、浸潤及細胞因子INF-γ、IL-17、IL-10、TGF-β1表達的影響，試圖闡明PD-L1在抑制大鼠肝移植急性排斥反應中的可能機制。 方法與結(jié)果： 第一部分近交系大鼠肝移植急性排斥模型的建立及排斥反應觀察 大鼠隨機分為3組：①G1(同基因肝移植組)；②G2(異基因肝移植組)；③G3(CsA組，移植后0～7d腹腔注射CsA2.5mg/Kg.d，余同G2)。采用改良“二袖套法”建立大鼠肝移植急性排斥模型。術(shù)后觀察一

6、般情況、平均存活時間(Median Survival Time，MST)，分別在術(shù)后3、7、14及21d采用全自動生化分析儀檢測肝功能，光鏡下觀察移植肝組織學變化，根據(jù)Banff標準判斷排斥反應強度。結(jié)果表明：在無外界干預的情況下，G1大鼠無急性排斥表現(xiàn)；G2受體多在術(shù)后7d出現(xiàn)耳廓黃染、尿黃等，至14d進行性加重伴血性腹水等；G3用藥期間大鼠精神差，停藥后逐漸恢復，至14d出現(xiàn)輕度急排表現(xiàn)；三組大鼠MST分別為：G1(106.7±0.

7、24)d，G2(18.3±1.15)d和G3(28.7±0.98)d，G3較G2明顯延長，差異顯著(P<0.05)；肝功及肝組織病理學改變早于上述表現(xiàn)，術(shù)后3d急排大鼠ALT、TBIL明顯升高伴輕度的排斥反應病理改變，7d后上述指標進一步惡化，至14d最為典型，與G1、G3相比差異顯著(P<0.05)；各時段排斥分級與病理變化趨勢一致：術(shù)后3d G3與G2急性排斥活動指數(shù)(ReiectionActivity Index，RAI)評分無明

8、顯差異，而7d、14d及21d G2 RAI評分明顯高于G1、G3(P<0.05)。 第二部分重組PD-L1-AAV2-RFP轉(zhuǎn)染大鼠移植肝的安全性和有效性 1.重組PD-L1-AAV2-RFP載體PCR鑒定：以重組載體為模板，在PCR儀上進行擴增反應，取PCR產(chǎn)物行1％瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察發(fā)現(xiàn)擴增條帶與預期的891bp大小的特異性條帶相吻合，表明PD-L1基因構(gòu)建正確。 2.重組PD-L1-AAV2-R

9、FP載體感染活性檢測：重組病毒感染BHK細胞后熒光顯微鏡下觀察RFP基因表達。結(jié)果表明PD-L1-AAV2一RFP感染后24h即可觀察到紅色熒光，48h后轉(zhuǎn)染率可達30％，表明其具有較強的感染活性，可用于體內(nèi)外轉(zhuǎn)染研究。 3.大鼠隨機分為3組：①G1(同基因肝移植組)；②G2(AAV空載體組，供肝切取后經(jīng)門靜脈灌注AAV2-RFP空病毒液夾閉冷轉(zhuǎn)染供肝2h，移植前乳酸林格氏液經(jīng)門靜脈沖洗供肝，余同G1)；③G3(PD-L1轉(zhuǎn)染組

10、，所用灌注液為PD-L1-AAV2-RFP，余同G2)。改良“二袖套法”建立大鼠肝移植基因轉(zhuǎn)染模型，于熒光顯微鏡下觀察移植肝RFP的表達，分別采用實時熒光定量RT-PCR、IHC從mRNA及蛋白水平檢測移植肝PD-L1的表達，肝功能及肝組織病理檢測同第一部分。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：ALT與TBIL分別于術(shù)后3d、7d達到峰值，14d基本恢復正常，各組間無顯著性差異；與未轉(zhuǎn)染組相比，PD-L1轉(zhuǎn)染后肝組織病理未見明顯差異；G2、G3術(shù)后7d即可在熒光

11、顯微鏡下觀察到微弱的紅色熒光，14、21d逐漸增強，呈高亮度的紅色熒光，而三組大鼠肝外器官中始終無紅色熒光；RT-PCR及IHC檢測顯示未轉(zhuǎn)染組PD-L1mRNA基因和蛋白均微弱表達；PD-L1轉(zhuǎn)染7d后隨時間延長靶基因表達逐漸增強，21d達峰值，主要位于匯管區(qū)周圍；除3d外，余各時段PD-L1基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達G3較G1、G2明顯增強(P<0.05)。 第三部分腺相關病毒介導的PD-L1表達對大鼠移植肝的保護作用及其機制

12、 大鼠隨機分為6組：①G1(同基因肝移植組)；②G2(異基因肝移植組)；③G3(AAV空載體組，供肝切取后經(jīng)門靜脈灌注AAV2-RFP空病毒液夾閉冷轉(zhuǎn)染供肝2h，移植前乳酸林格氏液經(jīng)門靜脈沖沈供肝，余同G2)；④G4(CsA組，移植后0～7d予腹腔注射CsA2.5mg/kg.d，余同G2)；⑤G5(PD-L1轉(zhuǎn)染組，所用灌注液為PD-L1-AAV2-RFP，余同G3)；⑥G6(聯(lián)合治療組，所用灌注液為PD-L1-AAV2-RFP，術(shù)后

13、0～7d予腹腔注射CsA2.5mg/kg.d，余同G2)。改良“二袖套法”建立大鼠肝移植模型，利用組織病理、IHC、ELISA等技術(shù)，觀察術(shù)后移植肝病理改變、PD-L1蛋白表達及其對移植肝CD4+、CD8+、CD25+細胞浸潤和細胞因子INF-γ、IL-17、IL-10、TGF-β1表達的影響。結(jié)果顯示：G1大鼠無急性排斥表現(xiàn)；肝功能損害較輕，ALT與TBIL分別于術(shù)后3d、7d達到峰值，14d基本恢復正常：肝臟病理學呈Banff0級排

14、斥反應；各時段PD-L1蛋白微弱表達；匯管區(qū)未見明顯淋巴細胞浸潤；IFN-γ無明顯表達，而IL-17、IL-10和TGF-β1呈低表達；大鼠MST為(106.7±0.24)d。G2、G37d開始出現(xiàn)急排表現(xiàn)，14d癥狀加重；肝功能指標明顯惡化；肝臟病理學呈Banff II～III級排斥反應，RAI評分隨時間推移逐漸升高；各時段PD-L1蛋白微弱表達；移植肝大量CD4+、CD8+、CD25+細胞浸潤；細胞因子IFN-γ、IL-17上調(diào)表達

15、，而IL-10、TGF-β1表達下降；大鼠MST為(18.3±1.15)d、(18.3±0.72)d。與G2、G3相比，G4、G5及G6大鼠發(fā)生急性排斥反應的時間均明顯延遲，直至14d才出現(xiàn)輕度排斥表現(xiàn)；肝功能部分改善，術(shù)后出現(xiàn)ALT、TBIL再次升高及肝功能衰竭的時間明顯推遲；肝臟病理學呈Banff I～II級排斥反應；G5、G6各時段移植肝PD-L1蛋白的表達隨時間逐漸增強，G4無明顯變化；移植肝CD4+、CD8+、CD25+細胞浸

16、潤明顯減少，尤以CD8+細胞為著(P<0.05)；移植肝細胞因子IFN-γ、IL-17含量顯著下降，而IL-10、TGF-β1含量明顯升高，差異顯著(P<0.05)；受體MST明顯延長，但未獲得長期存活，僅為(28.7±0.98)d、(29.3±1.47)d。PD-L1基因轉(zhuǎn)染聯(lián)合亞劑量CsA治療的大鼠各時段肝功能損害進一步減輕，RAI評分顯著降低，受體MST明顯延長至(34.0±1.49)d(P<0.05)。 四、結(jié)論：

17、 1.采用改良“二袖套法”成功建立了LEW-BN組合大鼠肝移植急性排斥模型。 2.冷保存期經(jīng)門靜脈灌注PD-L1-AAV2-RFP夾閉法轉(zhuǎn)染供肝，可安全、有效地將目的基因轉(zhuǎn)染至大鼠移植肝內(nèi)并分泌功能性蛋白。 3.在本實驗條件下，采用PD-L1-AAV2-RFP(1×1011v.g./只)經(jīng)門靜脈灌注夾閉冷保存2h是介導足量蛋白表達的理想方案。 4.腺相關病毒介導的PD-L1基因轉(zhuǎn)染對移植肝具有顯著的保護作用，可