腺相關(guān)病毒耳蝸局部基因轉(zhuǎn)染.pdf

1、第一部分不同徑路重組腺相關(guān)病毒在耳蝸細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率
　　目的:使用重組腺相關(guān)病毒作為基因轉(zhuǎn)染載體，分別通過耳蝸鼓階切開途徑、膠原酶處理后經(jīng)圓窗膜徑路、耳蝸中階切開途徑將病毒投放到內(nèi)耳，比較不同徑路的可靠性及安全性，為內(nèi)耳功能性基因轉(zhuǎn)染提供現(xiàn)實依據(jù)。
　　方法:選取經(jīng)閉合聲場聽性腦干反應(yīng)測試正常的Dunkin-Hartley豚鼠18只。按照不同的耳蝸給藥途徑分為三組:耳蝸鼓階切開途徑（A組）、膠原酶處理后經(jīng)圓窗膜徑路組（B組

2、）、耳蝸中階切開途徑（C組）。每組6只動物，隨機選擇單側(cè)耳注射攜帶綠色熒光蛋白基因的重組腺相關(guān)病毒(AAV-GFP，滴度3E^12PFU/mL)，對側(cè)耳采用相同的方法注射生理鹽水。術(shù)后兩周測試雙耳聽性腦干反應(yīng)，處死動物，并取出雙側(cè)耳蝸基底膜。采用免疫熒光技術(shù)進行染色，計算手術(shù)側(cè)毛細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率及毛細(xì)胞損失情況，并觀察對側(cè)毛細(xì)胞是否存在損傷及轉(zhuǎn)染情況。
　　結(jié)果:A組及B組的豚鼠術(shù)后兩周閉合聲場聽性腦干反應(yīng)顯示左右耳閾值與術(shù)前無明顯差

3、別。轉(zhuǎn)染表達(dá)產(chǎn)物的熒光信號主要分布在內(nèi)毛細(xì)胞，A組豚鼠在內(nèi)毛細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率是34％，外毛細(xì)胞3.6％;B組豚鼠內(nèi)毛細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率為26％，外毛細(xì)胞1.2％;A組豚鼠內(nèi)毛細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率略高于B組。C組豚鼠，術(shù)后閉合聲場聽性腦干反應(yīng)出現(xiàn)較明顯閾移，以4kHz最為明顯，內(nèi)毛細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率25％，外毛細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率3.7％?？梢娡饷?xì)胞損傷，且以第二回最為明顯。三組動物均未見對側(cè)耳蝸毛細(xì)胞損傷及轉(zhuǎn)染。
　　結(jié)論:經(jīng)耳蝸鼓階切開途徑、膠原酶處理后經(jīng)

4、圓窗膜徑路、耳蝸中階切開途徑均可將病毒注射到內(nèi)耳，并成功轉(zhuǎn)染毛細(xì)胞。但是，在內(nèi)外毛細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率偏低。耳蝸中階切開途徑可造成聽功能的損傷及毛細(xì)胞的損失，因此，在耳蝸局部基因轉(zhuǎn)染中的作用有限。
　　第二部分重組腺相關(guān)病毒滴度對轉(zhuǎn)染效率的影響
　　目的:比較不同滴度的表面酪氨酸殘基敲除的重組腺相關(guān)病毒載體在耳蝸毛細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率。
　　方法:選取經(jīng)閉合聲場聽性腦干反應(yīng)測試正常的Dunkin-Hartley豚鼠24只，按照

5、使用病毒的情況不同隨機分為三組:A組:投放重組腺相關(guān)病毒(AAV-GFP，滴度4E^12PFU/mL);B組:投放表面酪氨酸殘基敲除的重組腺相關(guān)病毒(mutant-AAV-GFP，滴度3E^12PFU/mL);C組:投放高滴度變異腺相關(guān)病毒(mutant-AAV-GFP，滴度7E^13PFU/mL)。多有動物均經(jīng)耳蝸鼓階切開途徑投放病毒。每只動物單側(cè)耳投放病毒5μL。手術(shù)后兩周測試雙耳閉合聲場聽性腦干反應(yīng)，處死動物后取雙側(cè)耳蝸基底膜，采

6、用免疫熒光技術(shù)染色計算手術(shù)側(cè)毛細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率及毛細(xì)胞損失情況，并觀察對側(cè)毛細(xì)胞的轉(zhuǎn)染情況。
　　結(jié)果:術(shù)后兩周閉合聲場聽性腦干反應(yīng)顯示，左右耳閾值與術(shù)前無明顯差別。三組豚鼠的毛細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率存在顯著差異。其中，C組豚鼠的內(nèi)、外毛細(xì)胞顯示出很高的轉(zhuǎn)染效率，內(nèi)毛細(xì)胞平均轉(zhuǎn)染效率為82％，外毛細(xì)胞為46％，部分動物的球囊毛細(xì)胞也可見轉(zhuǎn)染;B組豚鼠的毛細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率稍低，內(nèi)毛細(xì)胞平均轉(zhuǎn)染效率為44％，外毛細(xì)胞為8％;而A組豚鼠的毛細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率最

7、低，轉(zhuǎn)染的毛細(xì)胞主要集中在底回，而頂回幾乎沒有轉(zhuǎn)染。內(nèi)毛細(xì)胞平均轉(zhuǎn)染效率33％，外毛細(xì)胞3％。所有實驗動物未見明顯毛細(xì)胞損傷;對側(cè)耳毛細(xì)胞未見轉(zhuǎn)染信號。
　　結(jié)論:高滴度的變異腺相關(guān)病毒在耳蝸毛細(xì)胞轉(zhuǎn)染中具有極大的優(yōu)勢。病毒滴度的提高及病毒表面酪氨酸殘基的敲除提高了其在毛細(xì)胞中，特別是外毛細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率。且該病毒對聽功能及毛細(xì)胞無明顯損害，是目前基因轉(zhuǎn)染優(yōu)先選擇的載體。
　　第三部分腺相關(guān)病毒在新生小鼠耳蝸中的轉(zhuǎn)染

8、　　目的:使用變異的腺相關(guān)病毒在新生小鼠的耳蝸進行轉(zhuǎn)染，探索使用基因轉(zhuǎn)染來治療遺傳性聾的可行性。
　　方法:選用C57BL-6J小鼠（出生后7天）48只，分別使用經(jīng)圓窗膜穿刺和膠原酶處理圓窗膜后滲透兩種方式進行腺相關(guān)病毒耳蝸基因轉(zhuǎn)染。在膠原酶處理組中，分別使用不同濃度的膠原酶30mg/mL，60mg/mL，90mg/mL。比較經(jīng)圓窗膜穿刺和膠原酶處理圓窗膜后滲透兩種方式的聽功能損傷情況及耳蝸細(xì)胞的轉(zhuǎn)染情況。
　　結(jié)果:90m

9、g/mL膠原酶處理新生小鼠圓窗膜后，可導(dǎo)致明顯的聽功能損傷。使用30mg/mL膠原酶處理圓窗膜后，盡管沒有聽功能損傷，但是經(jīng)該途徑的腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染不成功。使用60mg/mL膠原酶處理圓窗膜后，沒有聽功能損傷，可在內(nèi)外毛細(xì)胞(IHC:47％，OHC:17％)及其他耳蝸細(xì)胞中可以看到轉(zhuǎn)染信號。經(jīng)圓窗膜穿刺途徑注射病毒，也沒有觀察到明顯的聽功能損失，在耳蝸內(nèi)外毛細(xì)胞(IHC:58％，OHC:19％)及其他耳蝸細(xì)胞中也可看到轉(zhuǎn)染。
　　結(jié)

10、論:通過經(jīng)圓窗膜穿刺途徑和60mg/mL膠原酶處理圓窗膜后滲透途徑，成功地實現(xiàn)了在新生小鼠耳蝸的局部基因轉(zhuǎn)染，為使用基因轉(zhuǎn)染治療遺傳性聾奠定了基礎(chǔ)。
　　第四部分重組腺相關(guān)病毒攜帶X連鎖凋亡抑制蛋白基因?qū)鬼樸K的耳毒性
　?。ㄒ唬┧倌?順鉑聯(lián)合作用建立耳毒性模型
　　目的:探討使用速尿-順鉑聯(lián)合作用建立耳毒性模型，并與順鉑連續(xù)注射比較聽功能、毛細(xì)胞損失的程度以及動物的死亡率
　　方法:選取健康豚鼠48只，并進行開

11、放聲場ABR測試。按照注射順鉑的劑量不同豚鼠隨機分為四組:A組，200mg/kg速尿注射后，給予0.1mg/kg順鉑;B組，200mg/kg速尿注射后，給予0.2mg/kg順鉑;C組，200mg/kg速尿注射后，給予2mg/kg順鉑;D組，3mg/kg順鉑連續(xù)注射5天。耳毒性藥物完成注射后一周，再次測試動物的開放聲場ABR，并處死動物，使用熒光染色技術(shù)觀察毛細(xì)胞的損傷情況。
　　結(jié)果:速尿-順鉑聯(lián)合作用可導(dǎo)致動物出現(xiàn)不同程度的聽功

12、能損傷。200mg/kg速尿與0.1mg/kg、0.2mg/kg、2mg/kg的順鉑聯(lián)合使用分別造成了11.6％、45.6％、97.7％的外毛細(xì)胞損傷。順鉑連續(xù)注射所造成的動物死亡率為45％，而使用速尿-順鉑聯(lián)合作用造成的動物死亡率為14％。后者明顯低于前者。
　　結(jié)論:速尿-順鉑聯(lián)合作用能夠高效地造成聽功能及外毛細(xì)胞損失，這種耳毒性模型的動物死亡率大大地低于順鉑連續(xù)注射造成的動物死亡率。
　?。ǘ┙?jīng)圓窗膜途徑注射順鉑建立

13、耳毒性模型
　　目的:探討使用經(jīng)圓窗膜注射順鉑建立耳毒性模型，評估這種耳毒性模型的聽功能、毛細(xì)胞損失的程度以及動物的死亡率
　　方法:選取健康豚鼠24只，并進行雙耳閉合聲場ABR測試。按照注射順鉑的劑量不同豚鼠隨機分為三組:A組，0.125mg/mL順鉑5μL;B組，0.25mg/mL順鉑5μL;C組，0.5mg/mL順鉑5μL。耳毒性藥物完成注射后一周，再次測試動物的閉合聲場聲場ABR，并處死動物，使用熒光染色技術(shù)觀察毛細(xì)

14、胞的損傷情況。
　　結(jié)果:經(jīng)圓窗膜注射順鉑可導(dǎo)致動物出現(xiàn)不同程度的聽功能損傷。0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL順鉑5μL經(jīng)圓窗膜注射分別造成了0.1％、13％、60％的外毛細(xì)胞損傷。該耳毒性模型的動物死亡率為10％。
　　結(jié)論:經(jīng)圓窗膜注射順鉑能夠高效地造成聽功能及外毛細(xì)胞損失，這種耳毒性模型的動物死亡率大大地低于順鉑連續(xù)注射造成的動物死亡率。
　　（三）重組腺相關(guān)病毒攜帶X連鎖凋亡抑制蛋白基

15、因?qū)鬼樸K的耳毒性
　　目的:探討使用重組腺相關(guān)病毒作為基因載體，攜帶X連鎖凋亡抑制蛋白基因(X-linkedinhibitorofapoptosisprotein，XIAP)進行耳蝸局部基因轉(zhuǎn)染來對抗順鉑介導(dǎo)的毛細(xì)胞死亡的可行性。
　　方法;選取健康豚鼠36只，將mutant-AAV-XIAP(滴度4E^13PFU/mL)經(jīng)耳蝸鼓階切開途徑投放到成年豚鼠的任意一側(cè)耳蝸，對側(cè)為對照耳，注射生理鹽水，所有試驗動物于手術(shù)后兩周分

16、別測試雙耳閉合聲場聽性腦干反應(yīng)，然后給予速尿-順鉑聯(lián)合注射，破壞外毛細(xì)胞。分別于耳毒性藥物注射后12小時、3天及7天，測試實驗動物雙耳閉合聲場聽性腦干反應(yīng)。聽力學(xué)測試完成后處死動物，行基底膜鋪片，使用熒光染色技術(shù)觀察毛細(xì)胞的損傷及局部凋亡產(chǎn)物的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:術(shù)后兩周，豚鼠雙耳的閉合聲場聽性腦干反應(yīng)閾值無明顯差異。在耳毒性藥物注射后12小時、3天及7天，雙耳閉合聲場聽性腦干反應(yīng)的閾值均上升，雙耳在各頻率的閾移沒有明顯差異。在

17、耳毒性藥物注射后12小時，即可觀察到外毛細(xì)胞損傷及凋亡產(chǎn)物，雙耳的外毛細(xì)胞損失量有明顯差異，注射病毒側(cè)耳蝸基底膜中的凋亡產(chǎn)物信號明顯少于注射生理鹽水側(cè)耳蝸的基底膜中的熒光信號。在耳毒性藥物注射后3天，雙側(cè)耳蝸基底膜上凋亡產(chǎn)物的量及外毛細(xì)胞損失量無明顯差異。耳毒性藥物注射后7天后，雙側(cè)耳蝸外毛細(xì)胞損失沒有明顯差別。
　　結(jié)論:通過耳蝸局部投放重組腺相關(guān)病毒搭載X連鎖凋亡抑制蛋白基因，能夠在順鉑損傷耳蝸外毛細(xì)胞的早期發(fā)揮作用，通過抑制