重組腺相關(guān)病毒經(jīng)圓窗膜途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)豚鼠耳蝸的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分膠原酶對(duì)豚鼠聽(tīng)覺(jué)功能及圓窗膜結(jié)構(gòu)的影響
　　目的:觀察圓窗龕放置Ⅰ型膠原酶對(duì)豚鼠聽(tīng)覺(jué)功能及圓窗膜結(jié)構(gòu)的影響，旨在探索在不引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物聽(tīng)力及圓窗膜形態(tài)不可逆性損傷的前提下，膠原酶的最佳作用濃度、劑量及時(shí)間。
　　方法:經(jīng)全頻程聽(tīng)性腦干反應(yīng)測(cè)試選取聽(tīng)力正常的健康豚鼠39只，隨機(jī)分為急性實(shí)驗(yàn)組及慢性實(shí)驗(yàn)組。急性實(shí)驗(yàn)組3只豚鼠，Ⅰ型膠原酶作用于圓窗膜后立即取材，以透射電鏡和掃描電鏡觀察圓窗膜的結(jié)構(gòu)改變。慢性實(shí)驗(yàn)組36只豚鼠，

2、按膠原酶濃度(30mg/ml-50mg/ml)、作用時(shí)間（5min或10min）及劑量(5μl或10μl)的不同組合分為12亞組，每組3只豚鼠。每只豚鼠雙耳給予膠原酶作用不同時(shí)間后吸出剩余液體并沖洗。術(shù)后4周，每周行聽(tīng)性腦干反應(yīng)測(cè)試，最后一次測(cè)試結(jié)束后取材，用透射電鏡和掃描電鏡觀察圓窗膜結(jié)構(gòu)改變。
　　結(jié)果:術(shù)后4周，取材時(shí)未見(jiàn)明顯中耳炎癥和中耳腔內(nèi)出血等反應(yīng)。30mg/ml濃度、5μl的Ⅰ型膠原酶作用于圓窗膜10分鐘對(duì)豚鼠圓窗膜

3、造成不同程度的急性損傷，掃描電鏡下見(jiàn)圓窗膜表面散在大小不等的裂隙狀破損，嚴(yán)重區(qū)域見(jiàn)上皮細(xì)胞部分游離，細(xì)胞表面以及緊密連接帶狀區(qū)微絨毛稀少或消失。透射電鏡下見(jiàn)各層細(xì)胞之間排列松散，細(xì)胞間隙增寬。50mg/ml及40mg/ml濃度的膠原酶作用于圓窗膜，無(wú)論總劑量或作用時(shí)間如何，均會(huì)導(dǎo)致不可逆的聽(tīng)覺(jué)功能損失，30mg/ml濃度的膠原酶在總劑量達(dá)到10μl時(shí)也是如此。而30mg/ml濃度、總劑量為5μl的Ⅰ型膠原酶放置于圓窗膜，作用5min或1

4、0min均對(duì)豚鼠造成一過(guò)性ABR閾值升高，各頻率平均閾值升高達(dá)5～20dB，4周后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物ABR閾值均恢復(fù)至術(shù)前水平，透射電鏡及掃描電鏡下見(jiàn)圓窗膜形態(tài)亦基本恢復(fù)正常。
　　結(jié)論:30mg/ml濃度、5μl的劑量，5～10分鐘作用時(shí)間，圓窗龕放置Ⅰ型膠原酶可一過(guò)性改變圓窗膜的結(jié)構(gòu)，提高圓窗膜通透性，并引起相應(yīng)的聽(tīng)覺(jué)功能障礙，而上述濃度、劑量及作用時(shí)間的圓窗膜膠原酶處理對(duì)豚鼠聽(tīng)覺(jué)功能及圓窗膜結(jié)構(gòu)并無(wú)不可逆影響，術(shù)后4周，豚鼠聽(tīng)覺(jué)功能及

5、圓窗膜結(jié)構(gòu)恢復(fù)至術(shù)前水平。
　　第二部分改良重組腺相關(guān)病毒載體提高目的基因在耳蝸局部轉(zhuǎn)染效率的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:采用能夠增強(qiáng)目的基因在耳蝸細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的CBA啟動(dòng)子，運(yùn)用定點(diǎn)突變技術(shù)敲除重組腺相關(guān)病毒載體表面的酪氨酸殘基以提高目的基因在耳蝸細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，并評(píng)估改良腺相關(guān)病毒載體的安全性。
　　方法:采用PCR技術(shù)克隆CBA啟動(dòng)子，通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)敲除暴露于病毒表面的酪氨酸殘基基因以構(gòu)建改良的腺相關(guān)病毒載體。經(jīng)全頻程聽(tīng)

6、性腦干反應(yīng)測(cè)試（閉合聲場(chǎng)給聲，分別測(cè)試兩耳的聽(tīng)力）選取聽(tīng)力正常的健康豚鼠18只，隨機(jī)分為三組，每組6只動(dòng)物，均經(jīng)耳蝸切開(kāi)途徑雙耳注射給藥。A組注射生理鹽水;B、C組分別注射改良及未經(jīng)改良的腺相關(guān)病毒載體。術(shù)后每周測(cè)試聽(tīng)力，2周后處死動(dòng)物取材，一耳行耳蝸基底膜鋪片，免疫熒光染色，計(jì)數(shù)耳蝸毛細(xì)胞缺失及病毒轉(zhuǎn)染效率;另一耳行蝸軸冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失及病毒轉(zhuǎn)染效率。
　　結(jié)果:術(shù)后2周改良AAV載體攜帶報(bào)

7、告基因在耳蝸底回內(nèi)、外毛細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率分別高達(dá)90％及50％以上;未經(jīng)改良的AAV載體在底回內(nèi)毛細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率在60％以上，外毛細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較低，僅有7％左右，從底回到頂回轉(zhuǎn)染效率逐漸降低，內(nèi)毛細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率明顯高于外毛細(xì)胞。耳蝸中軸冰凍切片熒光顯微鏡下觀察結(jié)果顯示:兩種載體從耳蝸底回到頂回均可見(jiàn)報(bào)告基因在螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的高效表達(dá)，各回的轉(zhuǎn)染效率均在80％左右。術(shù)后2周，三組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物聽(tīng)力與術(shù)前相比差異均無(wú)顯著性意義，且耳蝸毛細(xì)胞及螺旋神經(jīng)

8、節(jié)細(xì)胞均無(wú)明顯缺失。
　　結(jié)論:采用CBA啟動(dòng)子，通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)敲除暴露于病毒表面的酪氨酸殘基基因構(gòu)建的改良腺相關(guān)病毒載體可顯著提高目的基因在耳蝸細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，且安全可靠。
　　第三部分重組腺相關(guān)病毒經(jīng)不同轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在豚鼠耳蝸轉(zhuǎn)染效率的對(duì)比研究
　　目的:探討重組腺相關(guān)病毒載體經(jīng)耳蝸切開(kāi)及膠原酶處理的圓窗膜途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)豚鼠耳蝸的的可行性及安全性，為內(nèi)耳基因治療的進(jìn)一步臨床研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　方法:經(jīng)全

9、頻程聽(tīng)性腦干反應(yīng)(ABR)測(cè)試選取聽(tīng)力正常的健康豚鼠18只(36耳，隨機(jī)分為3組，每組12耳，其中6耳給予攜帶EGFP基因的AAV載體(AAV-EGFP)，另外6耳給予改良的AAV-GFP載體（mutant AAV-GFP）。A組經(jīng)完整圓窗膜途徑，B組經(jīng)耳蝸切開(kāi)途徑，C組則經(jīng)5μl的30mg/ml膠原酶處理圓窗膜10分鐘后給藥。各組于術(shù)后2周行ABR測(cè)試后處死取材，半數(shù)耳行基底膜鋪片，免疫熒光染色，計(jì)數(shù)耳蝸毛細(xì)胞缺失及病毒轉(zhuǎn)染效率;另外

10、半數(shù)耳行耳蝸中軸冰凍切片，熒光顯微鏡觀察，計(jì)數(shù)耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失及病毒轉(zhuǎn)染效率。
　　結(jié)果:術(shù)后2周，經(jīng)耳蝸切開(kāi)及膠原酶處理的圓窗膜途徑mutant AAV-GFP載體在耳蝸底回內(nèi)、外毛細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率均高達(dá)90％及50％以上;經(jīng)耳蝸切開(kāi)途徑AAV-EGFP載體在耳蝸底回內(nèi)毛細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率達(dá)60％以上，外毛細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較低，僅有7％左右，經(jīng)膠原酶處理的圓窗膜途徑AAV-EGFP轉(zhuǎn)染效率則略低于耳蝸切開(kāi)途徑;無(wú)論是耳蝸切開(kāi)途徑還是

11、膠原酶處理的圓窗膜途徑，兩種載體均實(shí)現(xiàn)了目的基因在螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞高效穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染，各回的轉(zhuǎn)染效率均在80％左右;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物各頻率ABR閾值與術(shù)前相比差異無(wú)顯著性意義，且耳蝸毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞均無(wú)明顯缺失;經(jīng)完整圓窗膜途徑未見(jiàn)報(bào)告基因在耳蝸毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的表達(dá)。
　　結(jié)論:腺相關(guān)病毒不能通過(guò)完整圓窗膜;無(wú)論是耳蝸切開(kāi)途徑還是經(jīng)膠原酶處理的圓窗膜途徑，改良AAV載體攜帶的報(bào)告基因均可在耳蝸內(nèi)外毛細(xì)胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞高效穩(wěn)定地轉(zhuǎn)