腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的Klotho基因轉(zhuǎn)染對去勢骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝的調(diào)控及作用機(jī)制.pdf

1、目的：克隆、構(gòu)建攜帶編碼小鼠全長膜型klotho(mKL)cDNA的腺相關(guān)病毒載體(rAAV.mKL)；并利用rAAV.mKL轉(zhuǎn)染去勢骨質(zhì)疏松大鼠，觀察KL對去勢骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝及骨微細(xì)結(jié)構(gòu)的影響，揭示KL在骨質(zhì)疏松骨代謝中的調(diào)控機(jī)制。
　　方法：(1)從小鼠腎臟組織中提取總RNA，RT-PCR擴(kuò)增小鼠全長mKL蛋白基因片段，將其克隆到pAAV-HnGFP質(zhì)粒上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pAAV-mKL，將其轉(zhuǎn)染COS-7真核表達(dá)細(xì)胞，通過

2、觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)、RT-PCR和免疫熒光檢測KL在COS-7中的表達(dá)，三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入AAV-293細(xì)胞，包裝rAAV.mKL；(2)rAAV.mKL轉(zhuǎn)染去勢骨質(zhì)疏松大鼠，觀察KL表達(dá)對骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝及骨微細(xì)結(jié)構(gòu)的影響。將SD雌性大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(S組)和手術(shù)組，外科去勢術(shù)后12周再隨機(jī)分為模型組(O組)、17β-雌二醇組(E組)、KL基因組(KO組)和空質(zhì)粒組(GO組)，實(shí)驗(yàn)12周后處死。ELISA法檢測

3、血漿KL、骨鈣素、雌激素表達(dá)水平；雙能X線檢測股骨、脛骨骨密度；冰凍切片及免疫組化法觀察腎KL熒光及KL蛋白表達(dá)；RT-PCR和免疫組化法檢測骨Runx2、MMP-13 mRNA及蛋白表達(dá)；HE染色觀察骨組織形態(tài)學(xué)變化；透射電鏡觀察骨細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。
　　結(jié)果：(1)通過RT-PCR獲得全長小鼠mKL cDNA片段，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pAAV.mKL，驗(yàn)證了其在COS-7細(xì)胞中高表達(dá)，三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染AAV-293細(xì)胞，包裝出rAAV

4、.mKL，提取病毒DNA，PCR驗(yàn)證rAAV.mKL攜帶有小鼠KL cDNA片段；(2)rAAV.mKL轉(zhuǎn)染可減緩去勢大鼠骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展并改善骨微細(xì)結(jié)構(gòu)的破壞。0組KL、骨鈣素、雌激素血漿表達(dá)明顯受到抑制，KO組KL、骨鈣素水平明顯升高；KO組和E組骨密度高于O組和GO組(P<0.05)；KO組大鼠腎有小鼠KL基因特異性表達(dá)；與O組相比，KO組Runx2 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，MMP-13 mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)；免疫組

5、化分析KO組Runx2吸光度值顯著高于O組(P<0.05)；KO組MMP-13吸光度值顯著低于O組(P<0.05)。HE顯示KO組、E組和S組大鼠骨小梁排列緊密，連接成網(wǎng)，形態(tài)結(jié)構(gòu)較完整，明顯優(yōu)于O組和GO組。透射電鏡顯示O組、GO組骨細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)髓樣結(jié)構(gòu)，而KO組、S組均未發(fā)現(xiàn)。
　　結(jié)論：(1)成功構(gòu)建攜帶全長mKL cDNA腺相關(guān)病毒載體，將其轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后可明顯上調(diào)KL的表達(dá)；(2)rAAV.mKL轉(zhuǎn)染去勢骨質(zhì)疏松癥大